日本血吸蟲體被蛋白SjRAD23和SjMBLAC1的初步研究.pdf

1、日本血吸蟲病是由日本血吸蟲(Schistosomejaponicum)感染所引起的一種嚴(yán)重危害人畜健康的寄生蟲病，當(dāng)前，該病流行于我國南方7省，給疫區(qū)人民和動物的健康造成嚴(yán)重威脅。目前還沒有有效的血吸蟲病疫苗，吡喹酮是唯一大規(guī)模使用的治療藥物，篩選疫苗候選分子和新的藥物靶標(biāo)是血吸蟲病防治研究的迫切需求。診斷在血吸蟲病防治過程中具有重要的作用，而現(xiàn)有的日本血吸蟲病診斷方法不能滿足診斷需求，因此尋求一種更為敏感、特異，并且具有療效考核價值的

2、診斷方法也是當(dāng)前的十分迫切。日本血吸蟲的體被是其與宿主相互作用的主要界面，在日本血吸蟲的生長發(fā)育中具有重要的作用，一些分布于體被上的表膜蛋白是重要的疫苗藥物靶標(biāo)和診斷抗原分子。前期本實驗室應(yīng)用蛋白組學(xué)技術(shù)系統(tǒng)分析了不同發(fā)育時期日本血吸蟲體被表膜蛋白，篩選出SjRAD23和SjMBLAC1兩個表膜蛋白，推測它們在血吸蟲寄生生活中可能起著重要作用。為探討這兩個基因的生物學(xué)功能，評估其作為疫苗候選分子的潛力以及診斷抗原的價值，本文開展了以下研

3、究。
　　1日本血吸蟲RAD23基因的克隆表達(dá)、特征分析及小鼠免疫保護(hù)效果評估
　　輻射敏感蛋白23具有核苷酸切除修復(fù)功能，在泛素蛋白酶體途徑中起到重要作用，是日本血吸蟲生長發(fā)育不可缺少的蛋白。本研究利用PCR技術(shù)克隆日本血吸蟲輻射敏感蛋白23(SjRAD23)編碼的cDNA序列，其ORF為1053bp。構(gòu)建了SjRAD23基因重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-SjRAD23，并在大腸桿菌BL21中成功誘導(dǎo)表達(dá)，重組蛋白分子量

4、大約44kDa，在上清和沉淀中均有表達(dá)。利用免疫組化技術(shù)觀察該蛋白廣泛分布在日本血吸蟲蟲體被膜。用重組蛋白免疫BALB/C小鼠后，免疫小鼠血清中檢測到較高水平的IgG、IgG1和IgG2a特異性抗體。Westernblotting分析結(jié)果顯示重組蛋白能夠被日本血吸蟲成蟲可溶性抗原免疫小鼠血清所識別，表明具有良好的免疫原性。應(yīng)用重組蛋白rSjRAD23結(jié)合佐劑206免疫小鼠與206佐劑對照組比較獲得了35.94％減蟲率和40.59％肝臟減

5、卵率，說明rSjRAD23在BALB/c小鼠中誘導(dǎo)產(chǎn)生了部分的免疫保護(hù)效果。
　　2日本血吸蟲MBLAC1基因的克隆表達(dá)、特征分析及小鼠免疫保護(hù)效果評估
　　金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBL)是一種依賴鋅離子的存在而發(fā)揮催化活性的酶，其底物涵蓋碳青霉烯類等在內(nèi)的多種β-內(nèi)酰胺類抗生素。本研究利用PCR技術(shù)克隆日本血吸蟲金屬-β-內(nèi)酰胺酶結(jié)構(gòu)域蛋白1(MBLAC1)編碼的cDNA序列，其ORF為711bp。構(gòu)建了SjMBLAC1基因重

6、組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-SjMBLAC1，并在大腸桿菌BL21中成功誘導(dǎo)表達(dá)，重組蛋白分子量大約33kDa，在上清和沉淀中均有表達(dá)。利用免疫組化技術(shù)觀察表明該蛋白廣泛分布在日本血吸蟲蟲體被膜。用重組蛋白免疫BALB/C小鼠后，免疫小鼠血清中檢測到較高水平的IgG、IgG1和IgG2a特異性抗體。Westernblotting分析結(jié)果顯示重組蛋白能夠被日本血吸蟲成蟲可溶性抗原免疫小鼠血清所識別，具有良好的免疫原性。重組蛋白rMBLA

7、C1結(jié)合206佐劑免疫小鼠與206佐劑對照組比較獲得了33.79％減蟲率和37.79％的肝臟減卵率。
　　3重組抗原rSjRAD23作為診斷抗原檢測家畜日本血吸蟲病
　　本文通過方陣試驗，優(yōu)化ELISEA實驗條件，以重組抗原rSjRAD23和日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原SjSEA作為診斷抗原，分別檢測了60份健康水牛血清和75份感染日本血吸蟲病水牛血清以及14份前后盤吸蟲感染牛血清和6份大片吸蟲感染牛血清，比較兩種抗原獲得的敏感

8、性、特異性;結(jié)果以重組抗原SjRAD23作為診斷抗原，特異性為98.33％;敏感性為89.33％，與前后盤吸蟲和大片吸蟲吸蟲的交叉反應(yīng)率分別為14.28％和0％。以蟲卵可溶性抗原SjSEA作為診斷抗原，特異性為91.67％;敏感性為100％，與前后盤吸蟲和大片吸蟲吸蟲的交叉反應(yīng)率分別為50％和16.67％。表明以重組抗原SjRAD23作為牛血吸蟲病診斷抗原，敏感性略低于SjSEA，但特異性及與其他寄生蟲交叉反應(yīng)性都好于SjSEA。以重組

9、抗原rSjRAD23和日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原SjSEA作為診斷抗原，平行檢測了實驗兔感染日本血吸蟲前，感染日本血吸蟲后2周、4周、6周以及用血吸蟲病治療藥物吡喹酮治療后每月兔血清中兩種抗原特異性抗體水平，分析兔血清中兩種特異性抗體的消長變化，評價兩種診斷抗原的療效考核價值。結(jié)果以兩種抗原作為診斷抗原，感染后2、4、6周都出現(xiàn)陽性反應(yīng)，以重組抗原rSjRAD23作為診斷抗原，在吡喹酮治療后的2個月、3個月、5個月各有一實驗兔轉(zhuǎn)陰;而以日