日本血吸蟲(chóng)重組SjTsp2-Sj29表膜蛋白疫苗對(duì)小鼠免疫效應(yīng)的研究.pdf

1、目的：日本血吸蟲(chóng)病(Sehistosomiasis japonicium)是一種嚴(yán)重危害人、畜健康的人獸共患寄生蟲(chóng)病。血吸蟲(chóng)病疫苗的研究可以作為滅螺、藥物防治和其他綜合防治措施的一項(xiàng)重要補(bǔ)充。本課題利用成功構(gòu)建好的含有日本血吸蟲(chóng)重組 Tsp2/Sj29表膜蛋白質(zhì)粒的菌株E.coli BL21/pET32a,誘導(dǎo)表達(dá)血吸蟲(chóng)重組 Tsp2/Sj29表膜蛋白,并利用其免疫小鼠,觀(guān)察SjTsp2/Sj29蛋白疫苗對(duì)小鼠的抗病免疫效應(yīng)。
　

2、　方法：pET32a/SjTsp2/Sj29重組菌種劃痕接種含氨芐LB固體培養(yǎng)基過(guò)夜,挑取單菌落,擴(kuò)大培養(yǎng),收集細(xì)菌,按照SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行質(zhì)粒提取。將抽提的重組質(zhì)粒用限制性?xún)?nèi)切酶Xho I和BamH I進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定。鑒定正確的菌種用氨芐LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)、IPTG誘導(dǎo)表達(dá),收集細(xì)菌、超聲破碎、分離、純化、變性與復(fù)性表達(dá)的重組蛋白,SDS-PAGE電泳法鑒定表達(dá)和純化的蛋白,并用BCA法測(cè)

3、定重組蛋白的濃度。29只6周齡雌性昆明鼠隨機(jī)分為A、B和C組,A和B組各10只,C組9只。A組免疫組即蛋白疫苗組,首次免疫每鼠經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射用等體積弗氏完全佐劑乳化的50μg SjTsp2/Sj29重組表膜蛋白,首次免疫12、24天后,分別在每鼠背部皮下再次多點(diǎn)注射用等體積弗氏不完全佐劑乳化的50μg該重組蛋白。B組對(duì)照蛋白組(硫氧還蛋白),即用pET32a空質(zhì)粒表達(dá)并純化的伴侶蛋白代替疫苗蛋白,免疫方法同 A組。C組為空白對(duì)照組,

4、用生理鹽水代替蛋白。末次免疫后第10天,每鼠經(jīng)腹部皮膚感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴(30±2)條。于感染45天后剖殺全部實(shí)驗(yàn)小鼠,眼眶取血,分離血清,間接性ELISA法檢測(cè)IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗體亞型和IgM抗體;同時(shí)檢測(cè)血清中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4水平;收集蟲(chóng)體并計(jì)數(shù);摘取肝臟,稱(chēng)重、消化,于顯微鏡下計(jì)蟲(chóng)卵數(shù),分別計(jì)算減蟲(chóng)率和減卵率;將小鼠部分肝組織做成切片進(jìn)行HE染色,觀(guān)察蟲(chóng)卵肉芽腫損害狀態(tài)。
　　結(jié)果：pE

5、T32a/SjTsp2/Sj29菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可大量表達(dá),經(jīng)變性、復(fù)性獲得純化的日本血吸蟲(chóng)Tsp2/Sj29重組表膜蛋白。免疫組與空白對(duì)照組比較,減蟲(chóng)率和減卵率分別為23.95％、55.57%(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,硫氧還蛋白組與空白對(duì)照組之間比較,減蟲(chóng)率和減卵率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);免疫組小鼠肝組織肉眼觀(guān)察色澤略帶暗紅色,質(zhì)軟,表面較光滑,隱約可見(jiàn)少量灰白色小點(diǎn),蟲(chóng)卵結(jié)節(jié)較少,較空白對(duì)照組形態(tài)學(xué)改變明顯減輕

6、;組織切片中免疫組小鼠肝細(xì)胞混濁腫脹,蟲(chóng)卵肉芽腫周?chē)装Y反應(yīng)輕,細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯,肉芽腫面積較小,與對(duì)照組比較,損害程度明顯減輕。免疫組鼠血清中IgG1、IgG2a和IgG2b顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05),IgG3和IgM較空白對(duì)照組沒(méi)有明顯區(qū)別;免疫組鼠血清IFN-γ、IL-4細(xì)胞因子水平高于空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);
　　結(jié)論：SjTsp2/Sj29重組表膜蛋白疫苗有一定的免疫保護(hù)效果;該重組蛋白免疫誘