嗜熱真菌蛋白激酶基因的克隆、表達與打靶載體構(gòu)建.pdf

1、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是外界同生物體或生物體細(xì)胞間的信息傳遞的重要手段，許多研究證實，生物信號在細(xì)胞內(nèi)傳遞的主要方式就是蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化的蛋白質(zhì)可逆磷酸化，通過磷酸化和去磷酸化作用使蛋白質(zhì)發(fā)生構(gòu)型和構(gòu)象的變化，從而調(diào)節(jié)其活性，通過激酶級聯(lián)信號傳導(dǎo)途徑將信號傳導(dǎo)到細(xì)胞核，通過對轉(zhuǎn)錄因子和離子通道蛋白的調(diào)控而調(diào)節(jié)基因的表達。
　　 本研究通過RT-PCR的技術(shù)克隆了嗜熱真菌Thermomyces lanuginosus的蛋白激酶基因，對其

2、進行生物信息學(xué)分析。構(gòu)建表達載體pPIC9K/pk和pPIC3.5K/pk并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，通過G418多拷貝篩選，選定轉(zhuǎn)化pPIC9K/pk胞外表達菌株和pPIC3.5K/pk胞內(nèi)表達菌株，分別命名為PS-PK-16和PS-PK-18。
　　 工程菌PS-PK-18的發(fā)酵產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)與對照組有明顯差異的蛋白，對此蛋白進行質(zhì)譜分析為ATPase，ATPase與細(xì)胞耐醇能力及維持胞內(nèi)pH穩(wěn)定等方面有重要作用。推測胞內(nèi)蛋白激

3、酶的過表達對菌體ATPase的表達產(chǎn)生影響，利于酵母菌抵抗外界的高滲透壓及醇類物質(zhì)給菌體帶來的傷害，提高酵母菌在高滲透壓，低營養(yǎng)物質(zhì)的不良環(huán)境中主動運輸?shù)男?，使酵母菌在搖瓶發(fā)酵過程中適應(yīng)不良的外界環(huán)境，維持菌體的正常生長。
　　 根據(jù)已知序列設(shè)計用于熒光定量PCR的蛋白激酶基因和管家基因的引物，對原始菌株及轉(zhuǎn)化得到的酵母工程菌株進行表達量的差異性分析。結(jié)果顯示，在原始菌株培養(yǎng)1～7天中，第一天的表達量最高，大約為其他六天的五十

4、倍左右，其余六天的表達量差異不大，這可能與在生長發(fā)育的初期，菌體代謝旺盛，參與生長發(fā)育的各種循環(huán)途徑基本都處于激活狀態(tài)，發(fā)揮作用的酶的數(shù)量較多，因此需要大量的蛋白激酶來對相關(guān)反應(yīng)進行調(diào)節(jié)；在構(gòu)建的酵母工程菌PS-PK-18發(fā)酵培養(yǎng)1～9天中，第四天的表達量最高，大約為其余八天的四倍左右，其余八天的表達量差異不大。
　　 依據(jù)同源重組原理，以pUCATPB為基礎(chǔ)構(gòu)建了蛋白激酶基因的敲除突變載體pUCATPB/PK。載體中分別取蛋白