Pkhd1基因條件性剔除打靶載體的構(gòu)建及其功能研究.pdf

1、常染色體隱性遺傳多囊腎疾病(autosomal recessive polycystic kidney disease，ARPKD)，也稱多囊腎肝病(polycystic kidney and hepatic disease，PKHD)，是一種兒童腎臟及肝臟相關(guān)的嚴(yán)重的遺傳病，患者均嬰幼兒時(shí)期起病，故又稱小兒多囊腎病(infantile polycystic kidney disease，IPKD)，發(fā)病率為1：20，000～1：40，

2、000。ARPKD的主要病理特點(diǎn)是腎臟集合管囊樣擴(kuò)張并伴有不同程度的膽囊發(fā)育不全、膽管擴(kuò)張以及先天性的肝門靜脈纖維化。在胎兒期發(fā)病的患者主要臨床表現(xiàn)為腎臟腫大和羊水過(guò)少，約30％的患者出生后很快就因?yàn)榉伟l(fā)育不全導(dǎo)致的呼吸功能障礙而死亡，但存活過(guò)圍產(chǎn)期的患者15年生存率可達(dá)80％，患者的發(fā)病和死亡主要與嚴(yán)重的系統(tǒng)性的高血壓、腎功能不全和匯管區(qū)纖維化導(dǎo)致的門脈高壓有關(guān)。目前尚無(wú)有效的治療方法?；颊咝枰M(jìn)行腎臟或肝臟移植，甚至需要做肝腎聯(lián)合移

3、植。 Zerres K等使用6個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，對(duì)16個(gè)ARPKD家系進(jìn)行連鎖分析，證實(shí)PKHD1基因突變導(dǎo)致ARPKD，并將其定位于染色體6p21上。PKHD1基因最大的開放閱讀框編碼的蛋白命名為polyduetin/fibrocystin，由4074個(gè)氨基酸殘基組成。PKHD1基因具有明顯的組織表達(dá)特異性，在腎臟中，PKHD1廣泛地在集合小管、遠(yuǎn)曲小管和髓絆(Henle's loop)升枝粗段表達(dá)。在肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，胰腺導(dǎo)管和

4、腎小管上皮細(xì)胞中，PKHD1也呈陽(yáng)性。電鏡和免疫熒光顯示，fibrocystin定位于細(xì)胞的頂端的纖毛中的基底小體。目前，對(duì)該基因功能及其編碼的蛋白功能了解不多，PKHD1基因在ARPKD發(fā)病中的作用也不清楚?；谝陨媳尘?，本文通過(guò)構(gòu)建小鼠Pkhd1條件性基因剔除打靶載體，為進(jìn)一步進(jìn)行ES細(xì)胞同源重組，獲得Pkhd1基因條件性基因剔除動(dòng)物模型打下基礎(chǔ)。同時(shí)，通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制PKHD1基因表達(dá)，研究 PKHD1基因?qū)GF誘導(dǎo)的細(xì)胞

5、過(guò)度增生的影響及其機(jī)制，可能對(duì)闡明 ARPKD發(fā)病機(jī)制和PKHD1基因功能有一定作用。其結(jié)果如下： 1.構(gòu)建小鼠Pkhd1條件性基因剔除打靶載體：以正常小鼠(129/SvJ)基因組DNA為模板，擴(kuò)增小鼠包括第6號(hào)外顯子的Pkhd1基因部分序列，通過(guò)引入LoxP和Neo基因等步驟，建立條件性剔除Pkhd1基因第6號(hào)外顯子的條件性基因打靶載體。構(gòu)建完成的Pkhd1基因條件性剔除打靶載體的5'同源臂為3.5 kb，3'同源臂為4.7

6、kb。選擇性標(biāo)記基因Neo基因和Pkhd1基因外顯子6位于loxP之間。載體經(jīng)XhoI酶切呈線性化，大小為15.3kb；PvuI酶切后得到2.1kb，13.2kb兩個(gè)片段；CpoI酶切后得到5.9kb，9.4kb；XhoI/CpoI雙酶切后得到1.6kb、4.3kb、9.4kb 3個(gè)片段；與預(yù)期的酶切結(jié)果相符合。經(jīng)測(cè)序證實(shí)，構(gòu)建的小鼠Pkhdl基因條件性打靶載體符合設(shè)計(jì)要求。 2.PKHD1基因shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及PKHD

7、I-silenced HEK-293T細(xì)胞株的建立：將PKHD1 shRNA1、PKHD1 shRNA2和HK-A序列克隆入pGenesil-2質(zhì)粒構(gòu)建了相應(yīng)的shRNA表達(dá)載體。分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，與未轉(zhuǎn)染的HEK-293T細(xì)胞比較，PKHD1 shRNA1和PKHD1 shRNA2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞24、48小時(shí)后，PKHD1 mRNA表達(dá)水平都有不同程度的降低(P<0.05)，其中PKHD1 shRNA2質(zhì)粒轉(zhuǎn)

8、染48小時(shí)后，PKHD1 mRNA的表達(dá)水平降低程度最大，抑制率達(dá)到75.91％。而轉(zhuǎn)染pGenesil-2和HK-A質(zhì)粒的HEK-293T細(xì)胞中PKHD1 mRNA的表達(dá)水平與未轉(zhuǎn)染的HEK-293T細(xì)胞相比，無(wú)顯著改變。使用PKHD1 shRNA2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞建立PKHD1shRNA2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。通過(guò)檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中PKHD1 mRNA的表達(dá)水平，PKHD1 mRNA的表達(dá)水平降低了83.63％，而轉(zhuǎn)染pGe

9、nesil-2和HK-A質(zhì)粒的細(xì)胞中PKHD1 mRNA的表達(dá)水平無(wú)明顯變化。 3.PKHD1 knockdown可顯著增高EGF誘導(dǎo)的ERK1/2信號(hào)通路活化，從而導(dǎo)致細(xì)胞異常增生：分別檢測(cè)了EGF對(duì)HEK-293T細(xì)胞、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGenesil-2的HEK-293T細(xì)胞、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HK-A的HEK-293T細(xì)胞，PKHD1-silenced HEK-293T細(xì)胞增生率的影響。發(fā)現(xiàn)PKHD1-silencedHEK-293T細(xì)胞

10、對(duì)EGF作用高度敏感，增生率為231.5％，明顯高于HEK-293T細(xì)胞的152.8％(P<0.01)，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGenesil-2或HK-A的HEK-293T細(xì)胞增生率分別為163.5％和155.5％，與HEK-293T細(xì)胞比較，則無(wú)顯著區(qū)別(P>0.05)。運(yùn)用ERK1/2磷酸化的特異性抑制劑PD98059處理上述各組細(xì)胞后，細(xì)胞對(duì)EGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增生明顯降低。通過(guò)檢測(cè)EGF對(duì)上述各組細(xì)胞的ERK1/2磷酸化的影響，發(fā)現(xiàn)PKHD1

11、-silencedHEK-293T細(xì)胞的ERK1/2磷酸化水平明顯高于HEK-293T細(xì)胞，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGenesil-2或HK-A的HEK-293T細(xì)胞則無(wú)顯著差別。 4.PKHD1 knockdown降低了HEK-293T細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>濃度：運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡檢NHEK-293T細(xì)胞、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGenesil-2的HEK-293T細(xì)胞、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HK-A的HEK-293T細(xì)胞，PKHD1-silenced HEK-29

12、3T細(xì)胞各組細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>濃度。與HEK-293T細(xì)胞比較，PKHD1-silencedHEK-293T細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>濃度顯著降低(p<0.001)。而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGenesil-2或HK-A的HEK-293T細(xì)胞的細(xì)胞Ca<'2+>濃度無(wú)顯著變化(p>0.05)。 5.細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>異常的降低導(dǎo)致了EGF誘導(dǎo)的ERK1/2信號(hào)通路的過(guò)度活化，從而引起細(xì)胞的過(guò)度增生：運(yùn)用Ca<'2+>通道阻斷劑Ver

13、apamil可降低細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>濃度。隨著Verapamil劑量的增加，細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>濃度明顯降低，呈劑量依賴關(guān)系。當(dāng)細(xì)胞運(yùn)用Verapamil處理4小時(shí)后，再加入20ng/ml EGF繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，與未經(jīng)Verapamil處理的HEK-293T細(xì)胞比較，細(xì)胞增生率為202.2％，顯著增高。如果同時(shí)加入ERK1/2磷酸化的抑制劑PD98059(20μM)，則細(xì)胞增生率顯著降低。通過(guò)檢測(cè)EGF對(duì)上述各組細(xì)胞的ERK1/2

14、磷酸化的影響，發(fā)現(xiàn)Veralpamil處理的HEK-293T細(xì)胞的ERK1/2磷酸化水平明顯高于未處理的HEK-293T細(xì)胞。Ca<'2+>通道激活劑Bay K8644能以劑量依賴的方式增高細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>濃度。Bay K8644增高細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>濃度對(duì)細(xì)胞增生并無(wú)顯著影響，但卻顯著降低了EGF誘導(dǎo)的PKHD1-silenced HEK-293T細(xì)胞的增生率(135.5％)。檢測(cè)EGF對(duì)上述各組細(xì)胞的ERK1/2磷酸化的影響，

15、發(fā)現(xiàn)Bav K8644處理的PKHD1-silencedHEK-293T細(xì)胞的ERK1/2磷酸化水平明顯低于未處理的細(xì)胞。 綜上所述，構(gòu)建的小鼠Pkhd1基因條件性基因剔除打靶載體符合設(shè)計(jì)要求，為進(jìn)一步進(jìn)行ES細(xì)胞同源重組，獲得Pkhdl基因條件性基因剔除小鼠模型打下基礎(chǔ)。同時(shí)，RNA干擾實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，PKHDl基因表達(dá)降低可顯著增高EGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增生，細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>異常的降低導(dǎo)致了EGF誘導(dǎo)的ERK1/2信號(hào)通路的