胃泌素釋放肽前體31-98片段核酸適配體的研究及其傳感器的構(gòu)建.pdf

1、核酸適配體（Aptamer）是利用配體指數(shù)富集的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment, SELEX）篩選得到的寡核苷酸片段，可以是單鏈DNA（single-stranded DNA, ssDNA）或者RNA。它可以與蛋白質(zhì)或其他物質(zhì)特異性結(jié)合，具有高選擇性和高親和力，具有比抗體更加穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，此外還具有低毒性、無(wú)免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，這使得核酸適配

2、體在蛋白檢測(cè)過(guò)程中有很大優(yōu)勢(shì)。通過(guò)SELEX技術(shù)可以簡(jiǎn)單快速得到高選擇性和高親和力的核酸適配體，在疾病的診斷和治療中具有很廣闊的前景。
　　胃泌素釋放肽前體31-98片段（Progastrin-releasing peptide31-98, ProGRP31-98）是一種高度可靠的、特異性的、靈敏的小細(xì)胞肺癌（Small Cell Lung Cancer, SCLC）腫瘤標(biāo)志物。血清中ProGRP31-98水平的測(cè)定使得對(duì)小細(xì)胞肺

3、癌的診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)及治療監(jiān)測(cè)成為可能。對(duì) ProGRP31-98水平的檢測(cè)主要是利用酶聯(lián)免疫技術(shù)（ELISA）、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)（CLIA）等免疫學(xué)方法。目前還沒(méi)有針對(duì)ProGRP31-98的核酸適配體被篩選出來(lái)，而本實(shí)驗(yàn)室利用SELEX技術(shù)篩選得到了8條針對(duì)ProGRP31-98的核酸適配體序列。
　　針對(duì)這些序列，我們從中選擇出了特異性較強(qiáng)的核酸適配體，以一種DNA分子光開(kāi)光化合物[Ru(bpy)2dppz]2+為探針，構(gòu)建了

4、一種無(wú)標(biāo)記的電化學(xué)發(fā)光方法對(duì)核酸適配體的特異性進(jìn)行檢測(cè)，得到了一條89 nt的ProGRP31-98核酸適配體以及它的隨機(jī)區(qū)域（48 nt）的核酸適配體。基于得到的兩條核酸適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)，得到了另外兩條經(jīng)過(guò)截短的40 nt和15 nt的核酸適配體，這些核酸適配體與ProGRP31-98具有很強(qiáng)的親和力，解離常數(shù)最低至16 nM。利用無(wú)標(biāo)記的電化學(xué)發(fā)光法可測(cè)得的最低檢測(cè)極限為17 nM。
　　由于血清中 ProGRP31-98水平

5、很低，這種無(wú)標(biāo)記的電化學(xué)發(fā)光測(cè)定法的靈敏度不足夠高。為了得到更加靈敏的檢測(cè)，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種電化學(xué)核酸適配體傳感器。首先將3-巰基丙酸（3-MPA）通過(guò)金硫鍵自組裝到金電極表面，經(jīng)1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亞胺（EDC）/N-羥基硫代琥珀酰亞胺（sulfo-NHS）活化表面羧基后固定鏈霉親和素；再在核酸適配體兩端分別修飾上巰基及生物素，誘導(dǎo)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)后與另一種巰基修飾的發(fā)夾DNA（hairpin DNA）共同連接到納米金

6、上形成雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)修飾的納米金復(fù)合物（hpDNA-AuNPs-Aptamer），該復(fù)合物作為信號(hào)放大元件，與 ProGRP31-98孵育后導(dǎo)致核酸適配體結(jié)構(gòu)改變使得生物素暴露，與鏈霉親和素作用連接到電極表面；再通過(guò)線性掃描（LSV）的方法將雙功能電化學(xué)指示劑[Ru(NH3)5L]2+嵌入到納米金復(fù)合物上的發(fā)夾 DNA中，利用差分脈沖伏安法（DPV）測(cè)得釕（Ⅱ）的氧化電流信號(hào)，其中 L為3-（2-菲-9-甲基-乙烯基）吡啶，能夠嵌入到雙鏈