KLHL21蛋白羧基端蛋白質(zhì)標簽的敲入及初步分析.pdf

1、KLHL（Kelch-like）蛋白家族是一類在進化中非常保守的蛋白質(zhì)，其典型的特征是都含有一個N端的BTB結(jié)構(gòu)域、5～6個羧基端的Kelch結(jié)構(gòu)域，以及介于它們之間的BACK結(jié)構(gòu)域。該家族蛋白的蛋白質(zhì)序列在進化中均非常保守，提示其在機體內(nèi)可能具有非常重要的生理功能。已有的研究表明，KLHL家族蛋白在細胞內(nèi)多通過與Cul3蛋白相互結(jié)合而形成E3泛素連接酶，催化底物蛋白質(zhì)的泛素化修飾，在機體的炎癥、氧化應(yīng)激、細胞有絲分裂、胚胎發(fā)育以及淋巴

2、生成等多種生命活動中發(fā)揮著重要的作用，但某些家族成員在細胞中還具有與催化蛋白質(zhì)泛素化修飾無關(guān)的其他功能。
　　作為KLHL蛋白家族中的一員，KLHL21蛋白含有一個BTB結(jié)構(gòu)域、BACK結(jié)構(gòu)域與5個Kelch結(jié)構(gòu)域。2009年，Maerki S等率先報道了，KLHL21可通過與Cullin3蛋白相互結(jié)合形成有功能的E3泛素連接酶，催化蛋白激酶AuroraB的泛素化修飾，在細胞有絲分裂后期參與調(diào)控染色體過客復(fù)合體(Chromosom

3、al passenger complex，CPC)從染色體向紡錘體中間區(qū)(spindle midzone)的轉(zhuǎn)運，采用siRNA抑制其在細胞中的表達可導(dǎo)致有絲分裂過程中胞質(zhì)分離(cytokinesis)的異常。來自該研究團隊最新的研究結(jié)果表明，KLHL21還可通過催化EB1蛋白的泛素化修飾而參與對細胞運動的調(diào)控。而前期的研究揭示，KLHL21是NF-κB信號通路中關(guān)鍵的IKK激酶復(fù)合物的特異性結(jié)合蛋白，可通過與IKKβ的激酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合而

4、抑制其激活，差異性地調(diào)控NF-κB下游靶基因的誘導(dǎo)表達，且該過程不依賴其E3泛素連接酶活性。
　　在前期的研究工作中，曾試用了來源自多個生物公司的KLHL21抗體，但普遍存在靈敏性與特異性不高的問題，為了后續(xù)研究的需要，本研究嘗試采用基因組編輯技術(shù)在HEK293T細胞內(nèi)源性表達的KLHL21蛋白的羧基端敲入mCherry與FLAG雙蛋白質(zhì)標簽。目前在實驗室中常用的基因組編輯技術(shù)有ZFN(zinc finger endonuclea

5、se,ZFN)、TALEN(transcription activator-like effector nuclease)與CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated)等三種，其中以2013年才首次報道的CRISPR/Cas系統(tǒng)因其操作相對簡單、低成本與基因組編輯的高效性而備受大家的關(guān)注。
　　CRIS

6、PR/Cas系統(tǒng)是存在于細菌和古生菌的一種適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)，通過序列特異性的RNA介導(dǎo)，切割并降解噬菌體、質(zhì)粒等外源入侵的遺傳物質(zhì)。當病毒首次入侵時，細菌將病毒基因的一段DNA序列整合進自身的CRISPR間隔序列區(qū)，其在病毒再次入侵時轉(zhuǎn)錄生成crRNA(CRISPR RNA)前體，前體crRNA再經(jīng)過加工后形成與外源性基因DNA序列匹配的成熟crRNA，通過與病毒基因組的同源DNA序列的識別而介導(dǎo)Cas蛋白切割病毒DNA將其沉默。目前

7、已經(jīng)被鑒定的CRISPR/Cas系統(tǒng)共有3種類型，其中Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)僅依賴于單一的Cas蛋白Cas9即可完成免疫防御，由于其操作簡單、要求低而被廣泛應(yīng)用于基因組編輯。
　　CRISPR/Cas9系統(tǒng)由5'端反式激活核糖核酸(trans-activating CRISPR RNA，tracrRNA)序列區(qū)、中間部分的Cas9基因編碼序列和3'端CRISPR間隔序列區(qū)在DNA鏈上線性排列組成。CRISPR間隔序列區(qū)由高度

8、保守的回文序列/反向重復(fù)序列R(Repeats)和長度約為30nt的間隔序列S(Spacers)有規(guī)律的間隔排列組成。Spacers經(jīng)轉(zhuǎn)錄和加工形成小干擾RNA分子crRNA，通過堿基互補配對識別靶DNA序列并引導(dǎo)Cas核酸酶對其進行切割。crRNA與靶DNA的互補配對區(qū)長度通常為20nt，這一過程中需要tracrRNA的參與，其通過與crRNA的部分序列互補配對而募集Cas9蛋白。在實際應(yīng)用中，可以將crRNA與tracr-RNA編碼

9、序列整合在一起，采用RNA轉(zhuǎn)錄酶Ⅲ啟動子如H1與U6進行表達，從而獲得向?qū)NA(guide RNA，gRNA)，此外也可以通過轉(zhuǎn)染體外合成或體外轉(zhuǎn)錄的gRNA來介導(dǎo)對靶DNA的切割。在gRNA識別的靶DNA序列的下游中含有一個PAM序列（protospacer adjacent motifs），通常為NGG三核苷酸序列（N代表任意核苷酸），是gRNA識別靶DNA序列所必需的。Cas9蛋白具有兩個核酸酶活性中心HNH與RuvC，它們分別

10、切割靶DNA雙鏈中的一條鏈，導(dǎo)致DNA雙鏈的平末端斷裂，繼而通過細胞的DNA同源重組或非同源性末端連接修復(fù)機制對斷裂的DNA進行修復(fù)，導(dǎo)致靶DNA序列的缺失與插入，引起靶基因讀碼框移位而達到敲除其在細胞內(nèi)表達的目的;或者在外源同源重組模板存在時對靶DNA序列進行替換、或者敲入一段外源DNA序列，通過這種對靶基因DNA序列進行的定點編輯可實現(xiàn)對細胞內(nèi)源性表達的靶基因功能或表達水平的調(diào)控，促進對靶基因功能與表達調(diào)控機制的深入研究。
　

11、　研究目的：
　　利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建KLHL21蛋白羧基端敲入蛋白標簽的HEK293T穩(wěn)定細胞株。
　　研究方法：
　　1、構(gòu)建含有mCherry-FLAG雙蛋白質(zhì)標簽的KLHL21基因同源重組模板質(zhì)粒，以及靶向人KLHL21基因終止密碼子附近DNA序列的gRNA表達載體;
　　2、將線性化的KLHL21基因同源重組模板質(zhì)粒、gRNA表達質(zhì)粒和人源化的hCas9表達載體共轉(zhuǎn)染入HEK293

12、T細胞中;
　　3、采用Blasticidin抗生素篩選獲得敲入目標蛋白質(zhì)標簽的HEK293T陽性細胞株;
　　4、采用PCR、Western Blot和免疫沉淀技術(shù)驗證篩選獲得的陽性HEK293T細胞株;
　　5、構(gòu)建Cre重組酶表達載體pCDNA3.1-Cre，將其轉(zhuǎn)染篩選獲得的敲入了目標蛋白質(zhì)標簽的HEK293T細胞株，利用Cre/Loxp位點特異性重組系統(tǒng)將兩端含有同向Loxp位點的Blasticidin篩選標

13、記基因序列切除。
　　研究結(jié)果：
　　1、成功構(gòu)建了用于人KLHL21蛋白羧基端敲入mCherry與FLAG蛋白標簽的載體pKCFD。
　　2、成功構(gòu)建了靶向人KLHL21基因終止密碼子附近序列的gRNA表達載體pHG4-21A與pHG4-21B。
　　3、利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功將mCherry與FLAG蛋白標簽敲入了內(nèi)源性KLHL21蛋白的羧基端。
　　4、采用抗生素Blasticidin成功

14、篩選到在內(nèi)源性表達的KLHL21蛋白羧基端敲入目標蛋白質(zhì)標簽mCherry-FLAG的HEK293T陽性細胞株。
　　5、通過Cre-Loxp位點特異性重組系統(tǒng)成功切除兩端含有同向Loxp位點的Blasticidin篩選標記基因序列。
　　研究結(jié)論：
　　成功地采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在HEK293T細胞中內(nèi)源性表達的KLHL21蛋白羧基端敲入mCherry與FLAG蛋白標簽，為后續(xù)KLHL21蛋白質(zhì)的功