利用Myf5誘導綿羊骨髓間充質(zhì)干細胞為成肌細胞的研究.pdf

1、生肌因子5(Myf5)為生肌決定因子(MyoD)基因家族。MyoD基因家族包括生肌決定因子(MyoD)、肌細胞生成素(Myogenin)、生肌因子5(Myf5)和生肌調(diào)節(jié)因子4(Mrf4)，它們具有單獨或協(xié)同調(diào)節(jié)肌細胞的增殖和分化、肌纖維大小和數(shù)量等功能。為了建立利用小鼠Myf5基因誘導綿羊骨髓間充質(zhì)干細胞為成肌細胞的方法，本研究在克隆小鼠Myf5基因的cDNA基礎上，依次通過克隆載體pMD18-T Simple和表達載體pcDNA3.

2、1(+)相連，構(gòu)建真核表達載體pcDNA3.1-Myf5;采用脂質(zhì)體法將pcDNA3.1-Myf5轉(zhuǎn)染綿羊骨髓間充質(zhì)干細胞，以觀察轉(zhuǎn)染細胞分化形成成肌細胞的能力。其研究結(jié)果如下：
　　1.Myf5基因真核表達載體的構(gòu)建
　　參照GenBank(AK044894)中序列，通過PCR擴增提取小鼠肌肉組織中的總RNA，擴增獲得Myf5基因，與克隆載體pMD18-T Simple相連，通過雙酶切和測序鑒定后，與表達載體pcDNA3.

3、1(+)表達載體連接。經(jīng)雙酶切鑒定和測序結(jié)果顯示，與理論序列相符，表明成功獲得Myf5基因的真核表達載體pcDNA3.1-Myf5;
　　2.骨髓間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)染和分化
　　將冷凍保存的綿羊骨髓間充質(zhì)干細胞，經(jīng)復蘇后進行傳代培養(yǎng)，其結(jié)果，培養(yǎng)細胞呈現(xiàn)正常的形態(tài)和生長曲線;當傳代培養(yǎng)后細胞約達到80％匯合時，分別進行下列處理。A組:轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Myf5無內(nèi)毒素質(zhì)粒，并加入含有0.5％DMSO的F12培養(yǎng)基;B組:轉(zhuǎn)染

4、pcDNA3.1-Myf5無內(nèi)毒素質(zhì)粒，加入F12培養(yǎng)基;C組:含0.5％DMSO的F12培養(yǎng)基。當轉(zhuǎn)染后第12d開始，在倒置顯微鏡下，3組轉(zhuǎn)染細胞均呈現(xiàn)成肌細胞樣的細管狀形態(tài)。
　　3.轉(zhuǎn)染細胞生物學檢測
　　(1)免疫熒光檢測在轉(zhuǎn)染細胞傳代培養(yǎng)后的第17d，將上述3種細胞和作為對照未經(jīng)轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細胞，用兔MyoD、MyoG、DES抗體處理進行免疫熒光檢測。其結(jié)果，與對照組不發(fā)生綠色熒光相比，三組轉(zhuǎn)染細胞均出現(xiàn)綠色

5、熒光;
　　(2)流式細胞篩選在轉(zhuǎn)染細胞傳代培養(yǎng)后的第21d，利用BD Accuri-C6個人型流式細胞儀對3組轉(zhuǎn)染細胞進行流式細胞篩選檢測，其結(jié)果，三組細胞中三種基因表達(Desmin、MyoD、MyoG)都在96.4％以上(A組，98.6％、99.9％、96.9％;B組，99.9％、98.0％、99.1％;C組，97.4％、96.4％、99.9％)
　　(3) Real-Time PCR檢測在轉(zhuǎn)染細胞傳代培養(yǎng)后的第28d

6、，對上述三種細胞和作為對照的骨髓間充質(zhì)干細胞采用實時定量PCR檢測（選取三對引物分別為MyoG，Myf5和Desmin，一組內(nèi)參引物GAPDH）。其結(jié)果，與轉(zhuǎn)染前細胞（標準化為1）相比，上述三種處理組的Myf5、MyoG和Desmi的相對表達量與均升高（A組分別為5.126±0.01倍、4.315±0.01倍和3.099±0.01倍;B組分別為4.484±0.01倍、3.124±0.01倍和2.889±0.01倍;C組分別為3.321±