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文檔簡介
1、黃素依賴型單加氧酶(FMO,E.C.1.14.13.8)是除了細胞色素P450(CYP450,E.C.1.14.14.1)之外,人類代謝系統(tǒng)中最重要的單加氧酶系統(tǒng)之一,它與外源物的代謝及毒物的多種應答有關。與真核生物的基因組中的FMO相比,細菌的FMO相對稀少,僅僅鑒定到一些典型的FMO。原核生物中第一種鑒定過的FMO蛋白(bFMO)來自噬甲基菌SK1(Methylophaga sp.strain SK1)中,得到可溶性FMO蛋白的X射
2、線結構能夠在2.6埃的分辨率上得以呈現(xiàn)。
所有哺乳動物的FMO對細胞膜都有著很強的結合,且蛋白水溶性很低,而目前為止沒有得到過任何哺乳動物的FMO晶體結構。細菌中的FMO則不存在此類問題,從而更適合于實際應用。又因其區(qū)域選擇和手性催化,以及穩(wěn)定性好等特點,在異源生物質代謝、藥代動力學和生物催化合成等領域受到了廣泛的關注。
本課題從原油污染的土壤樣品中建立宏基因組文庫,分離到一種能使吲哚變藍的轉化子,我們將此功能的fm
3、o基因命名為bfmoⅡ。生物信息學分析表明,bFMOⅡ與之前研究過的bFMO存在著許多差異性,體現(xiàn)在密碼子的使用偏好性不同等。序列比對表明,bFMOⅡ的許多結構與已結晶過的FMO蛋白有著很大相似性。系統(tǒng)發(fā)育樹的構建,證實了原核生物中FMO存在的多樣性,這為以后相應研究的進一步開展打下了基礎。
通過將基因連入克隆載體pMD18-T,導入大腸桿菌DH5α,能將LB培養(yǎng)基中由宿主菌代謝生成的吲哚,進一步轉化成生物靛藍,并對生物靛藍產
4、量做了初步測定;通過將基因連入載體pET-28a,導入到大腸桿菌BL21(DE3)中,能將吲哚及吲哚類衍生物轉化成不同色素,為之前未曾證實過的。
本研究建立了一套完整的bFMOⅡ蛋白誘導表達及純化的方案。在通過對bFMOⅡ蛋白誘導條件的選擇,確定了以含質粒pET-28a-FMO的大腸桿菌BL21(DE3)的酶表達體系。優(yōu)化了誘導表達條件,實驗選擇了低溫誘導(16℃),低濃度的誘導物(終濃度為0.3 mM IPTG),溫和的表達
5、環(huán)境(130 rpm),經過對誘導后菌體細胞的破壁,得到了大量的可溶性蛋白,為后續(xù)蛋白的純化打下了基礎。在酶的分離純化過程中,通過實驗摸索,發(fā)現(xiàn)了硫酸銨沉淀為酶純化過程的關鍵。通過硫酸銨沉淀,將破壁后的粗酶液中的bFMOⅡ蛋白進行了初步的捕獲,得到了滿意的實驗結果,獲得了均質的bFMOⅡ。
對純化后的bFMOⅡ的基本性質進行了研究。通過非變性凝膠電泳得知bFMOⅡ活性狀態(tài)下,分子量大小約為110 kDa,為同型二聚體,單體分子
6、量約為55 kDa。通過對酶純化過程中的顏色及對純酶的全波長掃描,發(fā)現(xiàn)bFMOⅡ內含有非共價結合的輔因子FAD,且在純化過程中容易丟失。通過bFMOⅡ的輔因子定量分析得知,酶中的一個亞基需要結合一個輔因子FAD。
對bFMOⅡ設計了四個可能存在的關鍵位點,并進行了點突變及活性驗證。通過觀察突變體對吲哚轉化的直接影響,確立了快捷的突變體活性檢測方法。結果說明,實驗所設計的四個位點相對應的氨基酸殘基,對bFMOⅡ的活性起著重要的活
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