二苯并噻吩單加氧酶催化特性及其催化吲哚合成靛類化合物的研究.pdf

1、在生物脫硫的“4S”途徑中，有4個(gè)酶參與，其中二苯并噻吩單加氧酶(Dibenzothiophene monooxygenase,DszC)是該途徑第一個(gè)起作用的酶，連續(xù)兩步氧化二苯并噻吩(Dibenzothiophene，DBT)生成二苯并噻吩砜(Dibenzothiophene sulfone，DBTO2)。DszC活力的發(fā)揮需要NADH:黃素氧化還原酶(NADH:flavin oxidoreductase，DszD)為其提供還原黃素

2、。DszC和DszD構(gòu)成黃素依賴型雙組分單加氧酶體系。DszC是該體系的單加氧酶組分，DszD是該體系的還原酶組分。黃素依賴型雙組分單加氧酶體系的單加氧酶組分一般是黃素專一性的，一些酶專一性利用FMNH2，另外一些酶則是專一性利用FADH2。既能夠利用FMNH2又利用FADH2的單加氧酶組分是非常稀少的，目前只有兩個(gè)單加氧酶組分報(bào)道有此能力。一個(gè)是Acinetobacter baumannii的p-羥基苯乙酸羥化酶(P-Hydroxyp

3、henylacetate hydroxylase)的C2組分，另一個(gè)是Streptomyces viridifacienshave MG456-hF10的異丁胺N-羥基化酶(Isobutylamine N-hydroxylase)。DszC利用黃素的專一性尚未明確，該酶是否能利用FADH2尚無(wú)確切結(jié)論。此外，黃素依賴型雙組分單加氧酶體系也是體內(nèi)活性氧的重要來(lái)源，過(guò)量活性氧的存在會(huì)對(duì)菌體造成毒害，因而抗氧化蛋白的表達(dá)對(duì)保持細(xì)胞內(nèi)活性氧的平

4、衡和細(xì)胞的正?；盍τ兄匾饬x。目前尚無(wú)與“4S”途徑脫硫相關(guān)的抗氧化蛋白的報(bào)道。生物降解和生物催化互相關(guān)聯(lián)，DszC的底物譜不僅限于DBT類化合物，該酶在生物催化領(lǐng)域的應(yīng)用潛力尚需挖掘。。 本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期從事生物脫有機(jī)硫的研究，篩選到多株有價(jià)值的脫硫菌株。本文以來(lái)自一株嗜熱脫硫菌MycobacteriumgoodiiX7B的DszC為研究對(duì)象，詳細(xì)研究了該單加氧酶對(duì)還原黃素利用的特點(diǎn)及黃素對(duì)酶活力的影響?？疾炝硕嘀昃曛忻摿蚧虻?/p>

5、表達(dá)與菌體的過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶表達(dá)的關(guān)系。探討了DszC在生物催化吲哚羥基化從而合成靛類化合物中應(yīng)用的潛力。 從一株嗜熱脫硫菌M.goodiiX7B克隆了dszC基因，并在大腸桿菌中大量表達(dá)后進(jìn)行純化，獲得了在SDS-PAGE電泳上表現(xiàn)為單一條帶(45kDa)的純酶。全波長(zhǎng)掃描表明該酶在280nm處有明顯光吸收，在300-700nm沒(méi)有光吸收，說(shuō)明該酶不結(jié)合血紅素或黃素。通過(guò)使用既能催化FMN還原又能催化FAD還原的Ds

6、zD，證明DszC既能夠使用FMNH2，也能使用FADH2作為底物催化DBT生成DBTO2。DszC的活力受到黃素種類、濃度、DszC與DszD之比的影響。使用FMNH2時(shí)的DszC比活力比使用FADH2時(shí)的比活力高，無(wú)論向DszCD的耦聯(lián)體系中添加FMN或FAD，低濃度的黃素都會(huì)增強(qiáng)酶活力，但是高濃度的黃素強(qiáng)烈抑制DszC的活力。在DszCD耦聯(lián)體系發(fā)揮作用時(shí)，還原態(tài)的黃素需要從DszD傳遞到DszC，在這個(gè)傳遞過(guò)程中，還原態(tài)黃素容易

7、被自氧化，自氧化的發(fā)生削弱了流向DszC的還原態(tài)黃素，同時(shí)還原態(tài)黃素自氧化產(chǎn)生的大量過(guò)氧化氫會(huì)使DszC和DszD失活，造成活力下降。提高黃素的濃度會(huì)加強(qiáng)這種自氧化作用，提高DszC的比例在一定程度上可以緩解這種自氧化造成的活力下降，通過(guò)向DszCD體系中添加過(guò)氧化氫酶及時(shí)移走過(guò)氧化氫，可以將DszC的活力提高一倍。 研究了原始脫硫菌株和基因工程菌株中脫硫基因表達(dá)和超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)

8、、過(guò)氧化氫酶(Catalase)表達(dá)之間的關(guān)系。分別使用Na2SO4、二甲基亞砜(Dimethylsulfoxide，DMSO)和DBT作為唯一硫源，考察原始脫硫菌中SOD表達(dá)圖譜的變化。在紅平紅球菌Rhodococcuserythropolis1awq中，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)和脫硫基因共同表達(dá)的超氧化物歧化酶，該誘導(dǎo)型酶在其他幾株原始脫硫菌株中不存在。目前，還沒(méi)有關(guān)于和脫硫基因共表達(dá)的SOD的報(bào)道。測(cè)定原始脫硫菌株和基因工程菌中過(guò)氧化氫酶活力的

9、變化，發(fā)現(xiàn)脫硫基因的異源表達(dá)會(huì)造成宿主菌自身的過(guò)氧化氫酶活力嚴(yán)重下降，但是在原始脫硫菌株中沒(méi)有這種情況發(fā)生。 最近十年，研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的黃素依賴型單加氧酶。這些單加氧酶可以高效而專一性氧化有機(jī)化合物，而且這類氧化反應(yīng)通常難以用化學(xué)方法催化。然而，到目前為止，科研人員只研究了少數(shù)幾種單加氧酶在催化合成中的應(yīng)用。造成這種狀況的主要原因有兩個(gè)：?jiǎn)渭友趺鸽y以表達(dá)和分離；另一個(gè)原因就是這些單加氧酶需要昂貴的NAD(P)H，不能以化

10、學(xué)計(jì)量添加。為此，從枯草芽孢桿菌168菌株克隆葡萄糖脫氫酶(Glucose dehydrogenase，GDH)基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌大量表達(dá)。利用從大腸桿菌純化得到的GDH構(gòu)建了NADH的再生體系，經(jīng)證明該體系可以代替NADH的直接加入，為DszCD耦聯(lián)體系提供源源不斷的NADH來(lái)催化DBT的氧化。該項(xiàng)結(jié)果為DszC用于生物催化奠定了基礎(chǔ)。 DszC可以催化吲哚生成被廣泛應(yīng)用的藍(lán)色染料——靛藍(lán)，該化合物具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。以吲哚

11、作為底物，研究了GDH的加入和DszC的催化活力之間的關(guān)系。GDH加入量的提高可以為DszCD體系提供在單位時(shí)間內(nèi)提供更多的NADH，增強(qiáng)DszCD的表觀催化能力，但是GDH的加入量仍然需要和DszD的活力保持一個(gè)平衡。GDH提供的NADH可以增強(qiáng)DszD的催化能力，體系中產(chǎn)生了更多的FMNH2，F(xiàn)MNH2固然可以增加DszC的活力，然而FMNH2的增加也會(huì)導(dǎo)致其自氧化的增強(qiáng)，并最終導(dǎo)致DszCD催化體系活力的下降。該輔因子再生體系的建

12、立為利用黃素依賴型雙組分單加氧酶進(jìn)行體外催化奠定了基礎(chǔ)。 全細(xì)胞催化體系可以減少還原黃素自氧化對(duì)催化活力的影響，提高催化效率，因此研究了重組大腸桿菌全細(xì)胞催化吲哚合成靛藍(lán)的應(yīng)用潛力。將DszD和DszC共表達(dá)可以大大提高細(xì)胞催化吲哚羥基化生成靛藍(lán)的能力，但是在此基礎(chǔ)上再共表達(dá)GDH則會(huì)削弱DszCD的表達(dá)，從而使細(xì)胞的催化能力下降。研究表明，當(dāng)菌體生長(zhǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)中期，加入1mMIPTG，轉(zhuǎn)入27℃繼續(xù)培養(yǎng)8h后收集細(xì)胞，可以得到

13、催化能力最高的菌體。轉(zhuǎn)化反應(yīng)適宜在pH6-7之間進(jìn)行，增高pH會(huì)降低靛藍(lán)產(chǎn)量，可能是影響了中間體向靛藍(lán)的轉(zhuǎn)化。細(xì)胞濃度對(duì)于終產(chǎn)物的濃度影響較大，控制裝液量為反應(yīng)器體積的20％時(shí)，理想的細(xì)胞濃度為OD600在20左右。在1-4mM范圍內(nèi)增加吲哚的濃度可以提高靛藍(lán)的濃度，但是相對(duì)于底物的轉(zhuǎn)化率則在降低，更高濃度的吲哚導(dǎo)致靛藍(lán)濃度降低大幅降低。這可能是吲哚破壞細(xì)胞膜造成的，可以考慮使用有機(jī)溶劑耐受菌株作為宿主來(lái)進(jìn)行該催化反應(yīng)。 在重組

14、大腸桿菌全細(xì)胞催化吲哚過(guò)程中檢測(cè)到一個(gè)紫紅色物質(zhì)，初步鑒定為靛玉紅。靛玉紅已被證明是有效的癌癥治療藥物，多項(xiàng)研究表明該化合物在諸多疾病的治療中都能起到作用，因而靛玉紅的規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義，通過(guò)取代基的變化，可以制作更適合藥用的靛玉紅類化合物。實(shí)驗(yàn)證明，表達(dá)DszC的全細(xì)胞也能夠以多種5-位取代吲哚作為底物，生成藍(lán)色和紅色化合物，推測(cè)為相應(yīng)的靛藍(lán)和靛玉紅取代物，說(shuō)明DszC和表達(dá)DszC的全細(xì)胞在催化合成靛玉紅類化合物中具有很大的應(yīng)用潛