與靈芝三萜合成相關(guān)的細(xì)胞色素p450單加氧酶基因的克隆

1、1與靈芝三萜合成相關(guān)的細(xì)胞色素P450單加氧酶基因的克隆摘要：靈芝(Ganodermalucidum)是我國(guó)最著名和最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的藥用真菌，靈芝三萜是靈芝的主要有效成分之一，具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種功效，是新藥研發(fā)的重要源泉。但是其單體難以通過(guò)化學(xué)分離或合成方法大量獲得已成為靈芝三萜類藥物研發(fā)的主要瓶頸，采用合成生物學(xué)思路在微生物中構(gòu)建異源次生代謝途徑是解決這一問(wèn)題的有效途徑。這一策略首先要解決的問(wèn)題是靈芝三萜次生代謝途徑中關(guān)鍵酶基因

2、的獲得及功能描述，細(xì)胞色素P450單加氧酶便是該途徑中最為重要的關(guān)鍵酶之一。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)由靈芝全基因組序列分析獲得的細(xì)胞色素P450候選基因序列設(shè)計(jì)引物，以靈芝菌絲cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，成功獲得單一的擴(kuò)增產(chǎn)物，且其大小與預(yù)期相一致。進(jìn)一步通過(guò)TA克隆、大腸桿菌轉(zhuǎn)化、菌落PCR及測(cè)序等工作驗(yàn)證其序列正確性，最終挑選出一條與原始序列完全一致的單克隆，可用于后續(xù)表達(dá)及功能驗(yàn)證等相關(guān)研究。鑒于細(xì)胞色素P450在靈芝三萜生物合成途徑中發(fā)

3、揮的巨大作用，本實(shí)驗(yàn)所獲之克隆可以為靈芝三萜合成生物學(xué)研究提供重要的數(shù)據(jù)參考和借鑒。關(guān)鍵詞：靈芝三萜；細(xì)胞色素P450；基因克隆；合成生物學(xué)3引言靈芝為擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)，多孔菌科(Polypraceae)靈芝屬(Ganoderma)真菌赤芝(Ganodermalucidum)和紫芝(G.Japonicum)的總稱。靈芝作為我國(guó)傳統(tǒng)的藥用真菌，幾千年來(lái)一直被用于疾病治療和延長(zhǎng)壽命，具有悠久的藥用歷史[12]。對(duì)于靈

4、芝的藥用記載最早出現(xiàn)在兩千多年前的《神農(nóng)本草經(jīng)》中，目前靈芝已被《美國(guó)草藥藥典與治療綱要》（AmericanHerbalPharmacopoeiaTherapeuticCompendium）收錄[3]，其藥用價(jià)值已得到世界各國(guó)的廣泛認(rèn)可。靈芝中含有多種生物活性物質(zhì)，截止目前，已有400多種不同的化合物被鑒定出來(lái)[4]，包括150余種萜類化合物[5]、靈芝多糖、蛋白質(zhì)、生物堿、氨基酸等，因此靈芝又有“生物活性成分細(xì)胞工廠”之稱[2]?，F(xiàn)代

5、藥理學(xué)研究已經(jīng)證明，靈芝具有多種重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值[2510]，例如抗腫瘤[810]、降血壓、抗病毒以及增強(qiáng)免疫能力等，其在疾病治療、新藥研發(fā)等領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。1靈芝三萜生物合成途徑及關(guān)鍵酶靈芝三萜與靈芝多糖是靈芝藥用活性成分的主要組成部分。同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)顯示：靈芝三萜通過(guò)甲羥戊酸途徑（MevalonicAcidPathway，MVP）合成[41112]，羊毛甾醇是所有靈芝三萜和麥角甾醇（真菌細(xì)胞膜的重要組分）的共同環(huán)狀前體，但是

6、目前對(duì)于靈芝三萜下游特異性合成途徑的研究還是空白，對(duì)于從單一前體羊毛甾醇形成種類繁多的靈芝三萜的分子機(jī)制還不清楚[11]。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所陳士林課題組分析了所有已知靈芝三萜的結(jié)構(gòu)和基團(tuán)修飾，首次提出了靈芝三萜的完整合成途徑，并認(rèn)為參與靈芝三萜下游途徑的修飾酶主要來(lái)自于細(xì)胞色素P450單加氧酶（CytochromeP450monooxygenases，CYP450）、乙酰基轉(zhuǎn)移酶（Acetylase，AT）和甲基轉(zhuǎn)移酶（Met

7、hyltransferase，MT）等超基因家族。靈芝三萜生物合成的甲羥戊酸途徑（MVP）主要分為三個(gè)階段：①以糖酵解產(chǎn)物乙酰輔酶A（AcetylCoA）作為原初底物，經(jīng)過(guò)甲羥戊酸（MevalonicAcid，MVA）中間產(chǎn)物合成異戊烯基焦磷酸(Isopentenyldiphosphate，IPP)和γγ二甲丙烯基焦磷酸(Dimethylallydiphosphate，DMAPP)；②經(jīng)過(guò)烯丙基轉(zhuǎn)移酶（Prenyltransferase