一株海綿共生芽孢桿菌代謝產(chǎn)物中的alphA-葡萄糖苷酶抑制活性化合物的分離.pdf

1、海洋環(huán)境微生物具有特有的代謝途徑和機體防御機制，與陸上和淡水微生物不同，產(chǎn)生的代謝物化學(xué)結(jié)構(gòu)具極大的新穎性和多樣性。從海洋微生物及其代謝產(chǎn)物中篩選和提取具有特異化學(xué)結(jié)構(gòu)的天然活性物質(zhì)是目前海洋環(huán)境生物資源開發(fā)的重要方向。Alpha-葡萄糖苷酶抑制劑是我國糖尿病防治指南推薦的一線藥物，alpha-葡萄糖苷酶抑制劑通過抑制alpha-葡萄糖苷酶的活性，使葡萄糖的生成和吸收減緩，從而減低餐后血糖峰值，調(diào)整血糖水平，減少血糖對胰腺的刺激，提高胰

2、島素的敏感性，保護胰腺的功能，有效預(yù)防并改善糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。但是，目前alpha-葡萄糖苷酶抑制活性化合物開發(fā)不足，備選化合物較少。
　　本研究針對一株海洋細菌HY95，進行了alpha-葡萄糖苷酶抑制活性的測定、菌株分類鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化、發(fā)酵液提取及活性產(chǎn)物穩(wěn)定性的研究，并利用活性測試指導(dǎo)下的天然產(chǎn)物分離手段，從菌株粗提物中分離純化了具有alpha-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物。主要研究結(jié)果如下:
　　(1) a

3、lpha-葡萄糖苷酶抑制活性的體外篩選模型的優(yōu)化研究通過對alpha-葡萄糖苷酶抑制活性的體外篩選模型的優(yōu)化，解決了測定結(jié)果不穩(wěn)定，樣本重現(xiàn)性較差的問題。本研究設(shè)計并開展了alpha-葡萄糖苷酶抑制活性的體外篩選模型的實驗方法的優(yōu)化，優(yōu)化后的測試方案為:在96孔板中加入82μL PBS、40μL PNPG和3μL待測樣品作為實驗組，于37℃保溫5 min，并加入25μLα-葡萄糖苷酶溶液后，測試混合后0min、5min、10 min、1

4、5 min、20min、25 min、30min、40 min的405 nm下的OD值讀數(shù)（記為OD0min），至反應(yīng)45 min時向體系中加入50μL Na2CO3中止反應(yīng)。以3μL阿卡波糖代替待測樣品作為陽性對照，以3μL DMSO代替待測樣品作為陰性對照，設(shè)置只加147μL PBS和3μL待測樣品為空白對照。抑制率計算方法為:根據(jù)各個時間點的OD值計算各個測試時間節(jié)點的α-葡萄糖苷酶活性抑制率IR，根據(jù)9個計算抑制率值繪制抑制率隨

5、時間變化的曲線圖，取IR20min、IR25min、IR30min的均值IR表示所測樣品抑制率IR。
　　驗證實驗表明，優(yōu)化后的體外篩選模型抑制率穩(wěn)定性更好，能提高抑制活性測試的抑制率數(shù)值的重現(xiàn)性。抑制率-時間曲線圖還能反映樣本抑制活性隨時間變化情況，不僅表明表征了樣品的alpha-葡萄糖苷酶抑制活性穩(wěn)定性，而且對樣品作為alpha-葡萄糖苷酶抑制劑的開發(fā)潛力做出判斷，繼而決定是否進一步分離純化。繪制抑制率-時間曲線圖還為分析粗提

6、物樣品的特點提供了新思路，為代謝產(chǎn)物的活性化合物分離純化過程提供了更加可靠的活性判斷依據(jù)。
　　(2)活性菌株HY95的分類鑒定本試驗對菌株HY95進行了16S rDNA測序分析，結(jié)合菌體形態(tài)和菌落生長特征，鑒定菌株HY95為Brevibacillus borstelensis（波茨坦短芽孢桿菌）。
　　(3)菌株HY95發(fā)酵條件的研究本研究通過4個培養(yǎng)條件因素（培養(yǎng)時間、接種量、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速）的單因子試驗設(shè)置，根據(jù)菌

7、株的生長情況，分析并優(yōu)化選擇了菌株HY95的培養(yǎng)條件。并利用alpha-葡萄糖苷酶抑制活性的體外篩選模型為指針，以粗提物的α-葡萄糖苷酶抑制活性為判斷依據(jù)，確定使其代謝產(chǎn)物中盡可能多的活性物質(zhì)產(chǎn)生的培養(yǎng)條件。
　　根據(jù)實驗結(jié)果得出，菌株HY95的最佳培養(yǎng)條件為:以2.5％（V/V)的接種量，在130rpm的搖床轉(zhuǎn)速下，28℃恒溫培養(yǎng)60 h。優(yōu)化后的海洋微生物培養(yǎng)基（Marine Broth，MB）配方為:蛋白胨5.00 g/L，

8、酵母粉1.50 g/L、氯化鈉9.725 g/L、氯化鎂5.90 g/L、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)3.24 g/L、氯化鈣1.80 g/L、氯化鉀0.55 g/L、檸檬酸鐵0.10 g/L，調(diào)整初始pH為7.5。
　　(4)菌株HY95活性物質(zhì)的分離鑒定對菌株HY95進行規(guī)模化發(fā)酵，獲得粗提物。并對粗提物進行活性測試指導(dǎo)下的分離純化，得到一個純化后的活性化合物。根據(jù)化合物樣品的核磁共振波譜譜圖和質(zhì)譜譜圖，可以鑒定出化合物為C