從廣西血竭中篩選、分離與分析α-葡萄糖苷酶抑制劑.pdf

1、本課題用新型交聯(lián)劑-三羥甲基磷(THP)固定α-葡萄糖苷酶，詳細研究了固定化的最佳條件和該固定化酶的物理化學性質(zhì)。該固定化α-葡萄糖苷酶的活性高，是用交聯(lián)劑-戊二醛固定該酶活性的9倍；在游離酶的最適pH條件下該固定化酶活性回收率為41.2％(若在固定化酶最適pH，回收率在60％以上)；另外該固定化酶的酸堿穩(wěn)定性、耐有機溶劑性、熱穩(wěn)定性以及貯存穩(wěn)定性都很高，這為課題后面的藥物篩選提供了可能，增大了藥物篩選的物質(zhì)范圍，使篩選的物質(zhì)既可以是酸

2、性物質(zhì)，也可以是堿性物質(zhì)，既可以是水溶性物質(zhì)，也可以是醇溶性物質(zhì)。另外該固定化方法為該酶的工業(yè)化應用提供了可能。 本課題把固定化α-葡萄糖苷酶設計為篩選模型對天然藥物進行篩選，該方法是模擬α-葡萄糖苷酶在體內(nèi)小腸壁上的情況，突破了用傳統(tǒng)游離酶篩選的方法。在實驗中，該篩選模型成功地對天然藥物-虎杖水提物和廣西血竭進行了篩選。與傳統(tǒng)方法相比，該篩選方法要更準確、更有效和更便利，而且易于操作，可以重復使用，適合大規(guī)模篩選含有α-葡萄糖

3、苷酶抑制成分的天然藥物。另外該模型還可以直接在體外評價抑制劑的作用效果，研究一些已知能夠治療糖尿病天然藥物的作用機理。 本課題用固定化α-葡萄糖苷酶膜對中藥血竭進行了親和篩選，經(jīng)用HPLC分析，確定保留時間為11.187、5.695、4.340、3.178、2.564、2.309min的物質(zhì)是有活性的。該方法可以盡量減少由于抑制劑在天然藥物中的量少而漏篩，而且靈敏、便捷，另外通過比較該篩選方法所得到的一些抑制劑來獲得構(gòu)效關(guān)系信息

4、，為進一步的藥學研究打下基礎(如先導化合物和候選藥物的確定)，該方法還具有快速，適用大規(guī)模篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑的特點。 本課題的親和篩選和分離的樣品是經(jīng)過預處理的廣西血竭，即乙酸乙酯萃取部位。目標化合物的分離是在親和篩選結(jié)果的指導下進行的，稱為活性導向分離(bio-activityguidedisolation)。對目標活性化合物的分離操作整合了多種分離技術(shù)，包括硅膠柱柱層析、Flash快速分離色譜、高效液相制備色譜和重結(jié)晶

5、方法。這種先篩選后分離的策略和在活性及指紋圖譜指導下的導向分離方法，與過去先分離后篩選的方法是不同的，過去的這種先分離后篩選的方法具有盲目性，大量的時間、人力和財力可能花在無活性成分的分離上，而本課題所采用的方法只是針對某一活性部位或成分進行分離，在活性和指紋圖譜指導下能較快分離得到活性成分。 本課題通過分離得到一個目標活性化合物，其活性比血竭全粉有很大提高，IC50為0.276μg/mL，它是一個競爭性抑制劑。借助紫外、紅外、