從廣西血竭中篩選、分離與分析α-葡萄糖苷酶抑制劑.pdf

1、本課題用新型交聯(lián)劑-三羥甲基磷(THP)固定α-葡萄糖苷酶，詳細(xì)研究了固定化的最佳條件和該固定化酶的物理化學(xué)性質(zhì)。該固定化α-葡萄糖苷酶的活性高，是用交聯(lián)劑-戊二醛固定該酶活性的9倍；在游離酶的最適pH條件下該固定化酶活性回收率為41.2％(若在固定化酶最適pH，回收率在60％以上)；另外該固定化酶的酸堿穩(wěn)定性、耐有機(jī)溶劑性、熱穩(wěn)定性以及貯存穩(wěn)定性都很高，這為課題后面的藥物篩選提供了可能，增大了藥物篩選的物質(zhì)范圍，使篩選的物質(zhì)既可以是酸

2、性物質(zhì)，也可以是堿性物質(zhì)，既可以是水溶性物質(zhì)，也可以是醇溶性物質(zhì)。另外該固定化方法為該酶的工業(yè)化應(yīng)用提供了可能。 本課題把固定化α-葡萄糖苷酶設(shè)計(jì)為篩選模型對(duì)天然藥物進(jìn)行篩選，該方法是模擬α-葡萄糖苷酶在體內(nèi)小腸壁上的情況，突破了用傳統(tǒng)游離酶篩選的方法。在實(shí)驗(yàn)中，該篩選模型成功地對(duì)天然藥物-虎杖水提物和廣西血竭進(jìn)行了篩選。與傳統(tǒng)方法相比，該篩選方法要更準(zhǔn)確、更有效和更便利，而且易于操作，可以重復(fù)使用，適合大規(guī)模篩選含有α-葡萄糖

3、苷酶抑制成分的天然藥物。另外該模型還可以直接在體外評(píng)價(jià)抑制劑的作用效果，研究一些已知能夠治療糖尿病天然藥物的作用機(jī)理。 本課題用固定化α-葡萄糖苷酶膜對(duì)中藥血竭進(jìn)行了親和篩選，經(jīng)用HPLC分析，確定保留時(shí)間為11.187、5.695、4.340、3.178、2.564、2.309min的物質(zhì)是有活性的。該方法可以盡量減少由于抑制劑在天然藥物中的量少而漏篩，而且靈敏、便捷，另外通過(guò)比較該篩選方法所得到的一些抑制劑來(lái)獲得構(gòu)效關(guān)系信息

4、，為進(jìn)一步的藥學(xué)研究打下基礎(chǔ)(如先導(dǎo)化合物和候選藥物的確定)，該方法還具有快速，適用大規(guī)模篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑的特點(diǎn)。 本課題的親和篩選和分離的樣品是經(jīng)過(guò)預(yù)處理的廣西血竭，即乙酸乙酯萃取部位。目標(biāo)化合物的分離是在親和篩選結(jié)果的指導(dǎo)下進(jìn)行的，稱(chēng)為活性導(dǎo)向分離(bio-activityguidedisolation)。對(duì)目標(biāo)活性化合物的分離操作整合了多種分離技術(shù)，包括硅膠柱柱層析、Flash快速分離色譜、高效液相制備色譜和重結(jié)晶

5、方法。這種先篩選后分離的策略和在活性及指紋圖譜指導(dǎo)下的導(dǎo)向分離方法，與過(guò)去先分離后篩選的方法是不同的，過(guò)去的這種先分離后篩選的方法具有盲目性，大量的時(shí)間、人力和財(cái)力可能花在無(wú)活性成分的分離上，而本課題所采用的方法只是針對(duì)某一活性部位或成分進(jìn)行分離，在活性和指紋圖譜指導(dǎo)下能較快分離得到活性成分。 本課題通過(guò)分離得到一個(gè)目標(biāo)活性化合物，其活性比血竭全粉有很大提高，IC50為0.276μg/mL，它是一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。借助紫外、紅外、