紫花苜蓿熱激蛋白基因MsHSP70的克隆及功能分析.pdf

1、熱激蛋白(HSP)是一種具有廣泛抗逆作用的保護(hù)性蛋白，主要作為分子伴侶在細(xì)胞保護(hù)、光合作用、遺傳繁育和脅迫應(yīng)激等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本文分析了紫花苜蓿熱激蛋白基因MsHSP70的特性及功能，旨在為苜蓿遺傳改良與抗逆品種選育提供理論依據(jù)。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1、利用同源克隆法，從紫花苜?？寺×艘粋€(gè)全長(zhǎng)為2146 bp熱激蛋白基因序列，命名為MsHSP70(GenBank accession No:KJ621409)。經(jīng)生物信息學(xué)

2、分析，該基因包含一個(gè)2028 bp開(kāi)放閱讀框，可編碼675個(gè)氨基酸，MsHSP70蛋白分子量為72.33 KDa，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋、β折疊組成。多序列比對(duì)結(jié)果顯示MsHSP70與截形苜蓿、豌豆、擬南芥HSP70的相似度分別為:94.47％、89.93％、78.72％。
　　2、通過(guò)亞細(xì)胞定位分析及在線預(yù)測(cè)，MsHSP70基因可定位于線粒體，經(jīng)過(guò)進(jìn)化樹(shù)分析可將MsHSP70歸類(lèi)到線粒體HSP70家族。成功構(gòu)建了MsHSP70

3、基因原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌，在IPTG誘導(dǎo)下在大腸桿菌中大量表達(dá)，聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明MsHSP70原核表達(dá)蛋白分子量與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。
　　3、利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)MsHSP70基因在苜蓿不同組織和非生物脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，MsHSP70在紫花苜蓿的花中表達(dá)量最大，莖和葉次之，根中最少;MsHSP70基因的表達(dá)受高溫、ABA、H2O2誘導(dǎo)，干旱和鹽脅迫下基因表達(dá)量沒(méi)有顯著變化。
　　4、構(gòu)建了

4、植物表達(dá)重組載體pCAMBIA1302-MsHSP70，并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化了擬南芥和紫花苜蓿，經(jīng)過(guò)抗性篩選和分子檢測(cè)，初步鑒定已獲得轉(zhuǎn)MsHSP70基因擬南芥和紫花苜蓿。
　　5、通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)MsHSP70基因擬南芥中MsHSP70基因表達(dá)分析，結(jié)果顯示MsHSP70基因受ABA、干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá);對(duì)T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗逆性分析顯示，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥在ABA和干旱脅迫下均表現(xiàn)為:丙二醛(MDA)含量較低，脯氨酸