擬南芥F-box基因AtPP2-B11的功能分析及蘋果RING finger型泛素連接酶E3的家族分析.pdf

1、泛素/26S蛋白酶體途徑是一類重要的翻譯后修飾過程，它能有效地調(diào)節(jié)功能蛋白質(zhì)的選擇性降解,是生命過程進(jìn)行精確時(shí)空調(diào)控的重要環(huán)節(jié)之一。其中，泛素連接酶E3是在底物的特異性選擇降解過程中作用最為關(guān)鍵成員。擬南芥基因組中大約5％的基因（大約1400多個(gè)基因）編碼泛素連接酶。在眾多的泛素連接酶類型中，F(xiàn)-boX型和RING finger型是家族成員最多的兩大類。本文通過對F-box和RING finger型基因的功能和結(jié)構(gòu)的分析，揭示了泛素連接

2、酶E3 在基因表達(dá)調(diào)控中的重要作用。結(jié)果如下：
　　 （1）本文首先分析了一個(gè)擬南芥F-boX類型蛋白的功能。利用生物信息學(xué)的方法，在擬南芥1488個(gè)泛素連接酶E3中分離到了31個(gè)含有DRE 元件的E3，通過RT-PCR的方法確定了它們在干旱處理下的表達(dá)量變化情況，并從中挑出了一個(gè)受干旱誘導(dǎo)較明顯的F-boX基因AtPP2-B11 進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。
　　 （2）qRT-PCR的實(shí)驗(yàn)證明，AtPP2-B11 受到干旱的

3、誘導(dǎo)。GUS活性實(shí)驗(yàn)表明，AtPP2-B11基因上游啟動(dòng)子區(qū)域的DRE 元件對于干旱響應(yīng)起到了一定作用。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)證明AtPP2-B11基因還受到ABA的部分誘導(dǎo)，表明AtPP2-B11基因可能是通過依賴ABA和不依賴ABA兩種途徑參與對干旱的響應(yīng)。
　　 （3）將AtPP2-B11基因轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中進(jìn)行干旱處理實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)AtPP2-B11基因明顯的減弱了植株的干旱抗性。qRT-PCR 檢測LEA14，COR15a，R

4、D29A等下游干旱響應(yīng)基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，在干旱處理時(shí)下游基因的RNA 水平均降低，干旱處理后下游基因發(fā)生了不同程度的下調(diào)，表明AtPP2-B11基因可能通過影響這些下游基因從而改變了植株的抗旱性。
　　 （4）通過酵母雙雜交系統(tǒng)，我們以AtPP2-B11蛋白為誘餌，篩選了擬南芥干旱誘導(dǎo)的cDNA 文庫，共得到約20個(gè)陽性克隆，測序后發(fā)現(xiàn)可以與AtPP2-B11蛋白發(fā)生相互作用的蛋白包括LEA14，HSP70等蛋白。利用酵母雙雜交和雙分

5、子熒光互補(bǔ)技術(shù)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，AtPP2-B11蛋白可以與LEA14蛋白發(fā)生相互作用，暗示了AtPP2-B11基因很可能作為一個(gè)負(fù)調(diào)因子，通過調(diào)節(jié)LEA14基因的活性來影響植株的干旱抗性。
　　 （5）另外，我們還利用生物信息學(xué)的方法對蘋果中的RING finger 型蛋白進(jìn)行了數(shù)量和結(jié)構(gòu)的預(yù)測及鑒定。我們發(fā)現(xiàn)在蘋果的基因組中有688個(gè)RING finger 結(jié)構(gòu)域分布于634個(gè)RING 型蛋白中。根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征我們將蘋果中的6

6、88個(gè)RING finger 結(jié)構(gòu)域分為9大類：367個(gè)RING-H2,208個(gè)RING-HC，10個(gè)RING-C2,35個(gè)RING-v，1個(gè)RING-D，11個(gè)RING-S/T,2個(gè)RING-G，10個(gè)RING-mH2和44個(gè)RING-mHC。其中，前7 類是在擬南芥中曾經(jīng)出現(xiàn)過的，后2 類是在蘋果中首次發(fā)現(xiàn)的。結(jié)構(gòu)分析描述了每一種RING 型結(jié)構(gòu)域的典型特征。同時(shí)還鑒定了RING 型蛋白中除了RING 結(jié)構(gòu)域以外的其他結(jié)構(gòu)域，為將來