呼吸道合胞病毒種系進(jìn)化特征的研究.pdf

1、呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)是引起嬰幼兒下呼吸道感染的主要病原，也是免疫缺陷患者和老年人群重要的呼吸道感染病原。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2013年RSV在全球?qū)е?3，000-65，000起5歲以下兒童死亡病例。依據(jù)抗原性和遺傳性的差異，可將RSV分為RSVA和RSVB兩個(gè)亞組。通過(guò)G蛋白胞外段第二高可變區(qū)基因序列(The Second Highly Variable Region，HVR2)的差異性

2、又將每個(gè)組進(jìn)一步分成多個(gè)基因型。雖然RSV僅有一個(gè)血清型，但自1955年首次發(fā)現(xiàn)至今，已發(fā)現(xiàn)了36個(gè)基因型。在新出現(xiàn)的基因型的突變中，除了基因的點(diǎn)突變，還出現(xiàn)了HRV2區(qū)域較大核苷酸片段插入突變，產(chǎn)生了B亞組BA型和A亞組的ON1型。對(duì)RSV變異進(jìn)化特點(diǎn)的研究表明，RSV G蛋白在病毒的進(jìn)化中存在氨基酸熱點(diǎn)突變，而G蛋白具有調(diào)控宿主免疫反應(yīng)的重要功能蛋白，提示這些突變位點(diǎn)在RSV持續(xù)流行具有重要意義。但是現(xiàn)有報(bào)道均是基于部分年限的研究，

3、且多基于HRV2基因區(qū)域。而自2005年后又發(fā)現(xiàn)有16個(gè)新基因型的流行，新基因型逐漸替代舊基因型。那么我國(guó)的RSV分子流行特點(diǎn)是什么，是否與全球其他國(guó)家報(bào)道的RSV流行具有相似的趨勢(shì)？基因型相關(guān)的基因突變與RSV進(jìn)化中相關(guān)氨基酸突變?cè)诓《具M(jìn)化中的動(dòng)力作用如何？作為進(jìn)化動(dòng)力研究的G基因，其第一高可變區(qū)(The First HighlyVariable Region，HVR1)是否在進(jìn)化中存在協(xié)同的氨基酸突變效應(yīng)等尚不清楚。本研究將對(duì)200

4、5年-2015年我國(guó)流行的RSV分子流行特征和近36年全球流行的RSV開(kāi)展種系進(jìn)化研究，為完善和闡明RSV的進(jìn)化變異特征提供數(shù)據(jù)參考。
　　本研究通過(guò)對(duì)2005年至2015年間收集的我國(guó)北京地區(qū)、山東省、甘肅省和云南省的1601份RSV核酸檢測(cè)陽(yáng)性的急性呼吸道感染病例樣本進(jìn)行G基因擴(kuò)增，獲得G全長(zhǎng)基因序列共514條，包括RSVA289條，RSVB225條。獲得HVR2基因共1238條，包括RSVA691條，RSVB547條。通過(guò)構(gòu)

5、建基于HVR2基因的最大似然法進(jìn)化樹(shù)，參考已發(fā)表序列進(jìn)行基因分型，將RSVA和B共分成14個(gè)基因型，RSVA包括NA1、NA2、NA3、NA4、GA5和ON1共6個(gè)基因型，RSVB包括BA4、BA7、BA9、BA10、BAC、GB3、CB1和SAB4共8個(gè)基因型。根據(jù)病例樣本的采集時(shí)間，繪制RSV及其基因型的時(shí)間分布圖，發(fā)現(xiàn)RSVA和RSVB可在同年共檢出，但以一種亞組為主，呈交替流行的特點(diǎn)。RSVA NA1基因型在2007年至2012

6、年A亞組流行季節(jié)呈優(yōu)勢(shì)流行，自2013年ON1首次檢出，并在隨后的兩個(gè)流行季檢出率逐年升高，替換NA1成為A亞組優(yōu)勢(shì)流行基因型。RSVB_BA9基因型在研究期間呈優(yōu)勢(shì)流行。2011年前我國(guó)流行的A和B亞組基因型已經(jīng)全部被替換。ON1基因型陽(yáng)性病例具有更高的肺炎診斷比率。BA10基因型陽(yáng)性病例中先天性心臟病病史診斷比率高于其他基因型。各亞組基因型的感染無(wú)性別差異(P=0.2059)。
　　為了深入分析RSV種系進(jìn)化特征，本研究分別基

7、于全長(zhǎng)G基因和HVR2基因，分析了全球近36年的RSV的種系進(jìn)化特征。通過(guò)貝葉斯-蒙特卡洛方法分析發(fā)現(xiàn)，B亞組較A亞組具有更快的堿基替換速率，其G基因和HRV2的平均替換速率分別為2.83×10-3，1.82×10-3;4.34×10-3，3.41×10-3堿基位點(diǎn)/年。B亞組具有陽(yáng)性選擇位點(diǎn)的基因型及陽(yáng)性位點(diǎn)更多。對(duì)RSV分子流行特點(diǎn)的研究發(fā)現(xiàn)A亞組中呈現(xiàn)了更多頻次的基因型的替換流行情況，B亞組則以BA9和BA10的持續(xù)流行為主。因此

8、上述發(fā)現(xiàn)的B亞組不同于A亞組的進(jìn)化特點(diǎn)可能與不同亞組基因型替換的頻次、優(yōu)勢(shì)流行基因型及基因型持續(xù)流行時(shí)間有關(guān)，提示A和B亞組在選擇壓力下具有不同的分子進(jìn)化特點(diǎn)。
　　基于G基因和HRV2基因?qū)亞組基因型的分析4個(gè)(225V、250P、274P和314P)和10個(gè)(215P、226L、233K、247L、256P、258H、262E、274L、280Y和314P)陽(yáng)性選擇位點(diǎn)(P＞95％，參考株為AB754590)。其中有三個(gè)基因

9、型出現(xiàn)了陽(yáng)性選擇，分別為GA5的第126L、262E和321Q、ON1的第273Y位和NA1的237D和274P，未發(fā)現(xiàn)這些陽(yáng)性選擇位點(diǎn)具有回復(fù)突變特點(diǎn)。對(duì)B亞組所有基因型的G和HRV2基因分析分別發(fā)現(xiàn)了5個(gè)(4H、219L、223P、252V和288V)和3個(gè)(221P、236K和249V)陽(yáng)性選擇位點(diǎn)（P＞95％，參考株JX198152）。其中基于每種基因型的分析發(fā)現(xiàn)5個(gè)基因型存在陽(yáng)性選擇位點(diǎn)，分別為BA3第216P，BA11第26

10、7F和285Y位，GB1第152P;BA9第4N、219L、268I、275I、276A、285Y和292Y，GB3第249V以及GB4第256G和312I為陽(yáng)性選擇位點(diǎn)。上述研究中發(fā)現(xiàn)HRV1區(qū)域雖然也存在陽(yáng)性選擇位點(diǎn)，但遠(yuǎn)少于HRV2區(qū)，提示G基因強(qiáng)陽(yáng)性選擇區(qū)域?yàn)镠RV2區(qū)?；谒谢蛐偷姆治雠c分別對(duì)每種基因型的分析獲得的陽(yáng)性選擇位點(diǎn)不同，表明基因型相關(guān)突變與特點(diǎn)基因型內(nèi)部氨基酸陽(yáng)性選擇突變?cè)诓煌瑏喗M進(jìn)化中的動(dòng)力作用，B亞組的抗原

11、表位相關(guān)的氨基酸陽(yáng)性選擇位點(diǎn)多于A亞組，這與A亞組主要流行基因型單一且基因型多樣性較B亞組少有關(guān)。對(duì)陽(yáng)性選擇位點(diǎn)的時(shí)序演化分析發(fā)現(xiàn)第221和268位具有回復(fù)突變特點(diǎn)。上述發(fā)現(xiàn)的陽(yáng)性選擇位點(diǎn)均位于抗原表位區(qū)，提示其病毒進(jìn)化中可能具有重要免疫調(diào)控功能，有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。但基于G基因和HRV2基因計(jì)算獲得的存在陽(yáng)性選擇的基因型及其陽(yáng)性選擇位點(diǎn)不完全一致，可能與參與計(jì)算的基因序列有關(guān)?；谀Ｐ陀?jì)算推測(cè)RSVA和B的起源時(shí)間分別在1950s和

12、1960s年。
　　綜上，本研究發(fā)現(xiàn)在我國(guó)A亞組中的6種基因型和B亞組中8種基因型的共流行。發(fā)現(xiàn)RSVA和RSVB交替流行、多種基因型的共流行和基因型的替換流行是RSV主要的分子流行特點(diǎn)。雖然不同國(guó)家同時(shí)期流行的基因型種類雖然略有差異，但均呈現(xiàn)A NA1和B BA基因型高流行，以及近兩年NA1被ON1替換特點(diǎn)。表明RSV在全球存在不依賴于地域的主要流行基因型及其替換模式的分子流行特點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)RSVB具有更快的堿基替換速率，且A亞組中