人呼吸道合胞病毒減毒疫苗侯選株的篩選.pdf

1、人類呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,HRSV)是各年齡組下呼吸道感染的主要病毒病原體之一，尤見于嬰幼兒、老年人及免疫缺陷病人等急性呼吸道感染住院者。世界衛(wèi)生組織已將研究RSV疫苗列為全球疫苗計劃的優(yōu)先發(fā)展項目之一。其中針對RSV的減毒活疫苗最具前景，因此我們計劃通過低溫連續(xù)傳代加化學誘變劑誘導突變的方式使RSV毒力降低，然后用蝕斑法克隆分離單一純系的病毒株，用敏感動物體內接種法來檢測R

2、SV毒力及免疫原性改變的情況，最終期望獲得在動物體內毒力很低但能有效誘導高水平免疫應答的減毒株作為疫苗候選株。實驗從研究內容上可分為針對RSV的基礎研究及低溫傳代減毒疫苗侯選株篩選兩部分。 第一部分針對RSV的一些基礎研究此部分對RSV的一些基本特征進行了探索。首先探討了不同細胞基質對RSV病毒生長情況的影響。在相同培養(yǎng)條件下，用單層KMB17細胞、Vero細胞、Hep-2細胞及Hela細胞培養(yǎng)原代RSV，觀察并記錄病毒引起細胞

3、病變的時間、病變的特點，檢測培養(yǎng)物的感染性滴度，比較4種細胞基質下RSV生長繁殖的特點。結果顯示用KMB17細胞培養(yǎng)RSV時，于第6天開始出現(xiàn)細胞病變，第12天細胞病變面積超過細胞總面積的75％，觀察不到明顯的合胞體病變特征，感染性滴度達6.13 lg CCID50/ml；用Vero細胞培養(yǎng)RSV時，于第3天開始出現(xiàn)細胞病變，第8天細胞病變面積超過75％，可觀察到明顯的合胞體病變特征，感染性滴度達6.83 lg CCID50/ml；用H

4、ep-2細胞及Hela細胞培養(yǎng)RSV時，于第5天開始出現(xiàn)細胞病變，第9天細胞病變面積超過75％，無明顯的合胞體病變特征，感染性滴度達6.83 lg CCID50/ml。由此可知4種細胞基質中KMB17細胞對RSV相對不敏感；而Vero細胞對RSV較其它3種細胞敏感，在短時間內細胞可出現(xiàn)明顯病變，并達到較高滴度；Hep-2細胞及Hela細胞培養(yǎng)RSV的敏感性相近，較Vero細胞稍弱。 由于病毒在體外培養(yǎng)過程中，吸附時間及維持液的p

5、H值可能對病毒的生長產(chǎn)生較大影響。我們在37℃下將RSV吸附不同時間進行培養(yǎng)，觀察吸附時間對病毒致細胞病變的影響。實驗證明RSV經(jīng)37℃吸附0分鐘、30分鐘、60分鐘、90分鐘后接種，對引起4種細胞病變的時間并沒產(chǎn)生明顯影響。另外配制pH6.4、pH6.6、pH6.8、pH7.0、pH7.2、pH7.4、pH7.6的細胞維持液用于培養(yǎng)RSV，比較在不同pH環(huán)境下病毒生長所受的影響?？擅黠@觀察到，在一定范圍內pH越高出現(xiàn)病變的時間越短；此

6、外，當pH值高于7.0時，引起的細胞病變形態(tài)以細胞圓縮死亡為主，而pH低于7.0的環(huán)境下可觀察到較多合胞體的病變現(xiàn)象；同時發(fā)現(xiàn)，RSV在pH7.2的維持液環(huán)境中生長，可獲得最高的感染性滴度，達6.63lg CCID50/ml，說明pH7．2左右的維持液較適RSV的生長。 研究除了用普通光學顯微鏡觀察細胞病變的方法來檢測RSV，還嘗試了電鏡切片、間接免疫熒光法來檢測RSV。實驗中取已出現(xiàn)細胞病變的KMB17細胞和Vero細胞制成電

7、鏡切片，觀察細胞在電子顯微鏡下的病變情況及病毒的存在與否，從照片上可看到RSV致兩種細胞病變的特點及許多類似病毒的顆粒。用間接免疫熒光法檢測病毒抗原，從照片上可看出在不同時段RSV在KMB17細胞、Vero細胞和Hela細胞上分布的情況，其中Vero細胞上可見到較多RSV對應的綠色熒光。 我們對RSV的動物模型做了初步探索。先是將原代RSV通過注射途徑接種到小鼠及其乳鼠的腦內，培養(yǎng)觀察它們的生長情況，到第14天時處死，解剖取腦和

8、肺組織做病理切片(HE染色)。結果所有經(jīng)腦內接種原代RSV的鼠飼養(yǎng)至第14天時全部存活，無明顯生長異常的現(xiàn)象，病理切片上也未見病理學改變。表明小鼠腦組織不是RSV侵蝕的主要靶器官，不適合研究RSV毒力強弱。后通過滴鼻途徑接種原代RSV到豚鼠鼻腔，除觀察生長情況及病理切片外，還檢測了豚鼠血清中和抗體的效價，并用細胞培養(yǎng)法分離豚鼠肺部的RSV。結果豚鼠經(jīng)接種RSV后，在第7天、14天處死時體重明顯低于正常對照組，呼吸較正常對照組急促，病理切

9、片顯示其已經(jīng)患有嚴重的間質性肺炎；14天時豚鼠血清中可檢測到1：4稀釋的抗體效價；而肺部組織可分離出低感染性滴度的RSV。所有結果顯示豚鼠可作為研究RSV毒力強弱的一種動物模型。 第二部分低溫傳代減毒疫苗侯選株的篩選本研究依據(jù)冷傳代培養(yǎng)病毒可以積累病毒株的溫度敏感效應的原理(僅一部分病毒有此特點)，通過接種RSV病毒至人胚肺KMB17細胞上，在低溫下進行持續(xù)傳代培養(yǎng)。用T特征實驗(檢測病毒在允許溫度和限制溫度下的滴度差值)檢測各

10、代病毒的溫度敏感特征。RSV在KMB17細胞上于37℃下已經(jīng)擴增了5代，病毒感染性滴度在6.01g CCID50/ml左右，在后續(xù)實驗中這幾代病毒可作為原代病毒對照使用；到目前為止，RSV在KMB17細胞上于32℃下已連續(xù)傳代至第20代，各代病毒病變的時間及收獲時間變動都較大，病毒感染性滴度仍是圍繞6.0 lg CCID50/ml上下波動，溫度敏感實驗中RSV在允許溫度和限制溫度下的滴度差值最大僅為1.5 lg CCID50/ml，未發(fā)

11、現(xiàn)明顯的溫度敏感性特征。 取低溫傳代第6代和第11代的RSV，用第一部分中接種原始代次RSV相同的方法經(jīng)滴鼻接種豚鼠，檢測毒力變化情況。結果顯示接種第6代和第11代病毒的豚鼠與陰性對照組相比，體重一致，呼吸正常，這兩個指標均未發(fā)現(xiàn)明顯差異。但這兩代病毒同樣引起了豚鼠肺部強烈的間質性肺炎，從病理損傷角度看，接種原代、第6代及第11代RSV的豚鼠在第7天時炎癥細胞均以呈結節(jié)狀和大片狀浸潤為主，似乎病變更嚴重，在第14天炎癥細胞呈彌漫

12、浸潤，接種這3代病毒的豚鼠的肺組織切片并未顯示出明顯不同。其中接種第11代RSV的一只豚鼠與其它相比，出血較明顯、肺泡結構呈片狀壞死，并可見小部分肺泡代償性氣腫，這是否由動物個體差異所致，還是病毒毒力所致尚不能確定。接種6代病毒的豚鼠14天時血清中可檢測到1：8的中和抗體效價，而接種11代病毒的豚鼠14天時血清中可檢測到1：4稀釋的抗體效價，可見第6代病毒在一定程度上更有效地刺激了豚鼠的體液免疫應答。從它們肺組織中分離出與原始代次一致、

13、4.0 lg CCIDso／ml左右低感染性滴度的RSV。以上結果提示，低溫傳代到第11代時，尚沒有明顯的減毒特征，需要進一步傳代。綜上所述，本研究探討了RSV的一些最基本的特征，為優(yōu)化病毒培養(yǎng)條件，研制理想的病毒疫苗株積累了初步的實驗資料。另外對RSV進行低溫傳代，并研究其毒力變化情況。從結果看來，經(jīng)過20代的冷傳代，病毒在KMB17細胞上的生長時程變動較大，還不具有溫度敏感特征。接種第6代和第11代病毒的豚鼠雖體重不再減輕，但仍患有