人呼吸道合胞病毒減毒疫苗侯選株的篩選.pdf

1、人類(lèi)呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,HRSV)是各年齡組下呼吸道感染的主要病毒病原體之一，尤見(jiàn)于嬰幼兒、老年人及免疫缺陷病人等急性呼吸道感染住院者。世界衛(wèi)生組織已將研究RSV疫苗列為全球疫苗計(jì)劃的優(yōu)先發(fā)展項(xiàng)目之一。其中針對(duì)RSV的減毒活疫苗最具前景，因此我們計(jì)劃通過(guò)低溫連續(xù)傳代加化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)突變的方式使RSV毒力降低，然后用蝕斑法克隆分離單一純系的病毒株，用敏感動(dòng)物體內(nèi)接種法來(lái)檢測(cè)R

2、SV毒力及免疫原性改變的情況，最終期望獲得在動(dòng)物體內(nèi)毒力很低但能有效誘導(dǎo)高水平免疫應(yīng)答的減毒株作為疫苗候選株。實(shí)驗(yàn)從研究?jī)?nèi)容上可分為針對(duì)RSV的基礎(chǔ)研究及低溫傳代減毒疫苗侯選株篩選兩部分。 第一部分針對(duì)RSV的一些基礎(chǔ)研究此部分對(duì)RSV的一些基本特征進(jìn)行了探索。首先探討了不同細(xì)胞基質(zhì)對(duì)RSV病毒生長(zhǎng)情況的影響。在相同培養(yǎng)條件下，用單層KMB17細(xì)胞、Vero細(xì)胞、Hep-2細(xì)胞及Hela細(xì)胞培養(yǎng)原代RSV，觀察并記錄病毒引起細(xì)胞

3、病變的時(shí)間、病變的特點(diǎn)，檢測(cè)培養(yǎng)物的感染性滴度，比較4種細(xì)胞基質(zhì)下RSV生長(zhǎng)繁殖的特點(diǎn)。結(jié)果顯示用KMB17細(xì)胞培養(yǎng)RSV時(shí)，于第6天開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞病變，第12天細(xì)胞病變面積超過(guò)細(xì)胞總面積的75％，觀察不到明顯的合胞體病變特征，感染性滴度達(dá)6.13 lg CCID50/ml；用Vero細(xì)胞培養(yǎng)RSV時(shí)，于第3天開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞病變，第8天細(xì)胞病變面積超過(guò)75％，可觀察到明顯的合胞體病變特征，感染性滴度達(dá)6.83 lg CCID50/ml；用H

4、ep-2細(xì)胞及Hela細(xì)胞培養(yǎng)RSV時(shí)，于第5天開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞病變，第9天細(xì)胞病變面積超過(guò)75％，無(wú)明顯的合胞體病變特征，感染性滴度達(dá)6.83 lg CCID50/ml。由此可知4種細(xì)胞基質(zhì)中KMB17細(xì)胞對(duì)RSV相對(duì)不敏感；而Vero細(xì)胞對(duì)RSV較其它3種細(xì)胞敏感，在短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞可出現(xiàn)明顯病變，并達(dá)到較高滴度；Hep-2細(xì)胞及Hela細(xì)胞培養(yǎng)RSV的敏感性相近，較Vero細(xì)胞稍弱。 由于病毒在體外培養(yǎng)過(guò)程中，吸附時(shí)間及維持液的p

5、H值可能對(duì)病毒的生長(zhǎng)產(chǎn)生較大影響。我們?cè)?7℃下將RSV吸附不同時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)，觀察吸附時(shí)間對(duì)病毒致細(xì)胞病變的影響。實(shí)驗(yàn)證明RSV經(jīng)37℃吸附0分鐘、30分鐘、60分鐘、90分鐘后接種，對(duì)引起4種細(xì)胞病變的時(shí)間并沒(méi)產(chǎn)生明顯影響。另外配制pH6.4、pH6.6、pH6.8、pH7.0、pH7.2、pH7.4、pH7.6的細(xì)胞維持液用于培養(yǎng)RSV，比較在不同pH環(huán)境下病毒生長(zhǎng)所受的影響?？擅黠@觀察到，在一定范圍內(nèi)pH越高出現(xiàn)病變的時(shí)間越短；此

6、外，當(dāng)pH值高于7.0時(shí)，引起的細(xì)胞病變形態(tài)以細(xì)胞圓縮死亡為主，而pH低于7.0的環(huán)境下可觀察到較多合胞體的病變現(xiàn)象；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，RSV在pH7.2的維持液環(huán)境中生長(zhǎng)，可獲得最高的感染性滴度，達(dá)6.63lg CCID50/ml，說(shuō)明pH7．2左右的維持液較適RSV的生長(zhǎng)。 研究除了用普通光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞病變的方法來(lái)檢測(cè)RSV，還嘗試了電鏡切片、間接免疫熒光法來(lái)檢測(cè)RSV。實(shí)驗(yàn)中取已出現(xiàn)細(xì)胞病變的KMB17細(xì)胞和Vero細(xì)胞制成電

7、鏡切片，觀察細(xì)胞在電子顯微鏡下的病變情況及病毒的存在與否，從照片上可看到RSV致兩種細(xì)胞病變的特點(diǎn)及許多類(lèi)似病毒的顆粒。用間接免疫熒光法檢測(cè)病毒抗原，從照片上可看出在不同時(shí)段RSV在KMB17細(xì)胞、Vero細(xì)胞和Hela細(xì)胞上分布的情況，其中Vero細(xì)胞上可見(jiàn)到較多RSV對(duì)應(yīng)的綠色熒光。 我們對(duì)RSV的動(dòng)物模型做了初步探索。先是將原代RSV通過(guò)注射途徑接種到小鼠及其乳鼠的腦內(nèi)，培養(yǎng)觀察它們的生長(zhǎng)情況，到第14天時(shí)處死，解剖取腦和

8、肺組織做病理切片(HE染色)。結(jié)果所有經(jīng)腦內(nèi)接種原代RSV的鼠飼養(yǎng)至第14天時(shí)全部存活，無(wú)明顯生長(zhǎng)異常的現(xiàn)象，病理切片上也未見(jiàn)病理學(xué)改變。表明小鼠腦組織不是RSV侵蝕的主要靶器官，不適合研究RSV毒力強(qiáng)弱。后通過(guò)滴鼻途徑接種原代RSV到豚鼠鼻腔，除觀察生長(zhǎng)情況及病理切片外，還檢測(cè)了豚鼠血清中和抗體的效價(jià)，并用細(xì)胞培養(yǎng)法分離豚鼠肺部的RSV。結(jié)果豚鼠經(jīng)接種RSV后，在第7天、14天處死時(shí)體重明顯低于正常對(duì)照組，呼吸較正常對(duì)照組急促，病理切

9、片顯示其已經(jīng)患有嚴(yán)重的間質(zhì)性肺炎；14天時(shí)豚鼠血清中可檢測(cè)到1：4稀釋的抗體效價(jià)；而肺部組織可分離出低感染性滴度的RSV。所有結(jié)果顯示豚鼠可作為研究RSV毒力強(qiáng)弱的一種動(dòng)物模型。 第二部分低溫傳代減毒疫苗侯選株的篩選本研究依據(jù)冷傳代培養(yǎng)病毒可以積累病毒株的溫度敏感效應(yīng)的原理(僅一部分病毒有此特點(diǎn))，通過(guò)接種RSV病毒至人胚肺KMB17細(xì)胞上，在低溫下進(jìn)行持續(xù)傳代培養(yǎng)。用T特征實(shí)驗(yàn)(檢測(cè)病毒在允許溫度和限制溫度下的滴度差值)檢測(cè)各

10、代病毒的溫度敏感特征。RSV在KMB17細(xì)胞上于37℃下已經(jīng)擴(kuò)增了5代，病毒感染性滴度在6.01g CCID50/ml左右，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中這幾代病毒可作為原代病毒對(duì)照使用；到目前為止，RSV在KMB17細(xì)胞上于32℃下已連續(xù)傳代至第20代，各代病毒病變的時(shí)間及收獲時(shí)間變動(dòng)都較大，病毒感染性滴度仍是圍繞6.0 lg CCID50/ml上下波動(dòng)，溫度敏感實(shí)驗(yàn)中RSV在允許溫度和限制溫度下的滴度差值最大僅為1.5 lg CCID50/ml，未發(fā)

11、現(xiàn)明顯的溫度敏感性特征。 取低溫傳代第6代和第11代的RSV，用第一部分中接種原始代次RSV相同的方法經(jīng)滴鼻接種豚鼠，檢測(cè)毒力變化情況。結(jié)果顯示接種第6代和第11代病毒的豚鼠與陰性對(duì)照組相比，體重一致，呼吸正常，這兩個(gè)指標(biāo)均未發(fā)現(xiàn)明顯差異。但這兩代病毒同樣引起了豚鼠肺部強(qiáng)烈的間質(zhì)性肺炎，從病理?yè)p傷角度看，接種原代、第6代及第11代RSV的豚鼠在第7天時(shí)炎癥細(xì)胞均以呈結(jié)節(jié)狀和大片狀浸潤(rùn)為主，似乎病變更嚴(yán)重，在第14天炎癥細(xì)胞呈彌漫

12、浸潤(rùn)，接種這3代病毒的豚鼠的肺組織切片并未顯示出明顯不同。其中接種第11代RSV的一只豚鼠與其它相比，出血較明顯、肺泡結(jié)構(gòu)呈片狀壞死，并可見(jiàn)小部分肺泡代償性氣腫，這是否由動(dòng)物個(gè)體差異所致，還是病毒毒力所致尚不能確定。接種6代病毒的豚鼠14天時(shí)血清中可檢測(cè)到1：8的中和抗體效價(jià)，而接種11代病毒的豚鼠14天時(shí)血清中可檢測(cè)到1：4稀釋的抗體效價(jià)，可見(jiàn)第6代病毒在一定程度上更有效地刺激了豚鼠的體液免疫應(yīng)答。從它們肺組織中分離出與原始代次一致、

13、4.0 lg CCIDso／ml左右低感染性滴度的RSV。以上結(jié)果提示，低溫傳代到第11代時(shí)，尚沒(méi)有明顯的減毒特征，需要進(jìn)一步傳代。綜上所述，本研究探討了RSV的一些最基本的特征，為優(yōu)化病毒培養(yǎng)條件，研制理想的病毒疫苗株積累了初步的實(shí)驗(yàn)資料。另外對(duì)RSV進(jìn)行低溫傳代，并研究其毒力變化情況。從結(jié)果看來(lái)，經(jīng)過(guò)20代的冷傳代，病毒在KMB17細(xì)胞上的生長(zhǎng)時(shí)程變動(dòng)較大，還不具有溫度敏感特征。接種第6代和第11代病毒的豚鼠雖體重不再減輕，但仍患有