人呼吸道合胞病毒微型基因組的研究.pdf

1、目的：人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus，RSV)是導(dǎo)致嬰幼兒嚴(yán)重下呼吸道感染的最重要的病毒病原，目前尚無(wú)有效的防治方法。利用RNA病毒反向遺傳學(xué)操作獲得的減毒RSV活病毒，具有穩(wěn)定的安全性和良好的免疫原性，用于制備RSV疫苗有較好的前景。該技術(shù)的關(guān)鍵在于首先得到含有整個(gè)病毒基因組的感染性cDNA克隆，然后在培養(yǎng)細(xì)胞中重新拯救出活病毒。RSV基因組為單股負(fù)鏈RNA，為加深對(duì)其基因組復(fù)制特

2、性的認(rèn)識(shí)，積累RSV拯救的必要知識(shí)，擬先嘗試構(gòu)建微型基因組(minigenome)，即在RSV轉(zhuǎn)錄起始和終止信號(hào)之間插入報(bào)告基因或較短的病毒基因組片段，兩端為病毒RNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄所必需的病毒前導(dǎo)序列和尾隨序列等調(diào)控序列，構(gòu)成cDNA來(lái)源的微型基因組，與表達(dá)輔助蛋白(N、P、L、M2-1)的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染或以RSV病毒作為輔助病毒在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，通過(guò)鑒定報(bào)告基因的表達(dá)即可初步鑒定所建立的微型基因組的功能。目前常用T7 RNA聚合酶(

3、T7 RNAPolymerase，T7 RNP)將含有病毒微型基因組的重組質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄合成病毒的基因組。RNA。本研究旨在探討T7轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)及功能，并進(jìn)一步構(gòu)建攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced Green FluorescentProtein，EGFP)基因的RSV微型基因組重組質(zhì)粒，通過(guò)轉(zhuǎn)染可表達(dá)T7 RNP的BSRT7/5細(xì)胞系，并以RSV作為輔助病毒觀察EGFP的表達(dá)情況，明確RSV微型基因組的功能，為研究RSV感染性c

4、DNA奠定基礎(chǔ)。 方法：根據(jù)編碼T7 RNP的基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引入EcoR Ⅴ和Xho Ⅰ酶切位點(diǎn)的引物。提取含有T7 RNP的Ecoli BL21(DE3)基因組DNA，以該DNA為模板，應(yīng)用PCR技術(shù)，擴(kuò)增T7 RNP全長(zhǎng)基因，經(jīng)過(guò)中間載體將其克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)。與此同時(shí)，將px8δt載體切下的T7 RNP轉(zhuǎn)錄識(shí)別的終止信號(hào)(Terminator，TER)和從pGEM-T easy/EGFP上切下的E

5、GFP基因克隆至pcDNAⅡ，且保證EGFP位于T7啟動(dòng)子與TER之間。將獲得的兩個(gè)重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞。48 h后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察EGFP在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。同時(shí)，根據(jù)文獻(xiàn)獲得RSV轉(zhuǎn)錄復(fù)制時(shí)所需的最小順式作用元件，即轉(zhuǎn)錄起始(Gene Start，GS)信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止(Gene End，GE)信號(hào)以及基因組啟動(dòng)子(Leader)與反基因組的啟動(dòng)子(Trailer)序列。設(shè)計(jì)好信號(hào)序列的順序并在其中引入多克隆酶切位點(diǎn)，命名

6、為GSGE，基因合成得到GSGE的cDNA，以該段序列為模板合成兩對(duì)分別在上下游帶有T7啟動(dòng)子的引物，同時(shí)在T7啟動(dòng)子端引入Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，行PCR，得到的產(chǎn)物分別命名為GSGE1和GSGE2，之后將這兩段序列克隆入px8δT載體，并進(jìn)一步將EGFP基因定向克隆至其中得到兩個(gè)含有RSV微型基因組的重組載體，分別命名為px8δT/GSGE1/EGFP和px8δT/GSGE2/EGFP。為驗(yàn)證這兩個(gè)重組載體中RSV微型基因組的功能，通

7、過(guò)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染BSR T7/5細(xì)胞系，進(jìn)一步利用RSV作為輔助病毒提供RSV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制必須的所有功能蛋白，72h后在倒置熒光顯微鏡下觀察報(bào)告基因EGFP的表達(dá)情況。 結(jié)果：成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/T7 RNP和重組載體pcDNAⅡ/EGFP/TER。在共轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞后，熒光顯微鏡下可觀察到EGFP表達(dá)的綠色熒光。成功構(gòu)建含有RSV微型基因組的px8δT/GSGE1/EGFP和px8δT/GSGE2/EGF

8、P載體，轉(zhuǎn)染BSR T7/5細(xì)胞，以RSV作為輔助病毒，倒置熒光顯微鏡下觀察到BSR T7/5細(xì)胞表達(dá)綠色熒光。 結(jié)論：pcDNA3.1(+)/T7 RNP可在真核細(xì)胞BHK內(nèi)表達(dá)T7 RNP，通過(guò)與T7啟動(dòng)子和TER的相互作用，實(shí)現(xiàn)了pcDNA Ⅱ/EGFP/TER中EGFP基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。構(gòu)建的帶有RSV微型基因組的重組載體，在RSV的輔助下可實(shí)現(xiàn)EGFP的成功表達(dá)，微型基因組具有RSV病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的功能，為進(jìn)一步的RS