呼吸道合胞病毒亞單位疫苗的研究.pdf

1、呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）屬副黏病毒科，肺炎病毒屬，為非節(jié)段性的負(fù)鏈RNA病毒。RSV基因組有15，222個(gè)核苷酸，主要編碼10個(gè)特異性蛋白，其中膜表面的融合蛋白F和粘附蛋白G是激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體的最主要的病毒表面抗原，是疫苗研究開(kāi)發(fā)的重要內(nèi)容。呼吸道合胞病毒（RSV）廣泛流行于世界各地，是引起嬰幼兒下呼吸道感染最常見(jiàn)的病原微生物之一。世界衛(wèi)生組織（WHO）已將RSV疫苗列為全球

2、疫苗計(jì)劃中優(yōu)先發(fā)展的疫苗之一。RSV疫苗研制雖已有40年歷史，但至今尚無(wú)被批準(zhǔn)使用．的疫苗。 為此，本研究利用桿狀病毒昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了RSV全長(zhǎng)的F、G蛋白，免疫Balb/c小鼠，評(píng)價(jià)了F和G全長(zhǎng)蛋白疫苗的免疫原性和有效性。運(yùn)用生物信息學(xué)軟件選擇F205～223，255～278，G142～204位氨基酸作為研究對(duì)象，表達(dá)并純化了F—G融合表位蛋白。該研究為進(jìn)一步研制適合我國(guó)的RSV疫苗奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。 RSV F和G全長(zhǎng)重組蛋

3、白疫苗的質(zhì)粒構(gòu)建、表達(dá)和純化目的表達(dá)并純化RSV Long株F和G全長(zhǎng)蛋白。方法采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT—PCR）克隆了RSV A型Long株的全長(zhǎng)F和G基因，構(gòu)建了F—pFastHT A和G—pFastHT A質(zhì)粒。將陽(yáng)性重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒質(zhì)粒F—Bacmid和G—Bacmid。將其轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，成功包裝了含有目的片段的重組桿狀病毒，采用Ni2+離子親和層析柱純化了接毒細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物。進(jìn)行S

4、DS—PAGE電泳、間接免疫熒光和Western—blot試驗(yàn)鑒定重組蛋白。結(jié)果目的蛋白F和G在昆蟲(chóng)細(xì)胞中有特異性表達(dá)， Ni2+離子親和層析柱能夠很好的吸附重組目的蛋白。結(jié)論成功克隆了RSV F和G基因，并在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中獲得表達(dá)。Ni2+離子親和層析法純化目的蛋白的純度達(dá)85％以上，可用于免疫Balb/c小鼠。 RSV F和G全長(zhǎng)重組蛋白和表位肽疫苗免疫效果的研究目的檢測(cè)RSV F和G蛋白候選疫苗的免疫原性和安全性。方法選用Mf5

5、9分別與F、G蛋白配制疫苗滴鼻免疫Balb/c小鼠；弗氏佐劑與F和G蛋白配制疫苗肌肉注射免疫Balb/c小鼠做為對(duì)照。分別采用間接ELISA法和微量中和試驗(yàn)檢測(cè)免疫鼠血清特異性IgG和中和抗體效價(jià)；間接ELISA法檢測(cè)免疫鼠肺、鼻灌洗液特異性IgG和SIgA抗體效價(jià)；MTT法檢測(cè)免疫鼠脾淋巴細(xì)胞增殖：ELISPOT法檢測(cè)免疫鼠脾臟淋巴細(xì)胞γ—IFN、IL—2、IL—4分泌。結(jié)果經(jīng)桿狀病毒昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的RSV F和G全長(zhǎng)蛋白在Balb

6、/c小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生了高滴度的血清IgG抗體、中和抗體和肺局部抗體，其中F蛋白疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生了平衡的IgG1/IgG2a。結(jié)論RSV F蛋白可刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫：G蛋白疫苗只刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫，并引起Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答。 RSV F—G表位肽疫苗的質(zhì)粒構(gòu)建、表達(dá)及純化目的選擇能同時(shí)刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫并誘導(dǎo)平衡的Th1/Th2應(yīng)答的RSV表位蛋白。方法運(yùn)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)F和G蛋白的空間結(jié)構(gòu)，并查看資料尋找F和G蛋白

7、的抗原表位。選擇F205～223，255～278，G142～204位氨基酸作為研究對(duì)象，合成編碼這兩段表位的基因，采用重疊PCR將編碼F和G兩段表位的基因連接，桿狀病毒昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)F—G融合表位肽蛋白，Ni2+親和層析純化目的蛋白。結(jié)果融合表位蛋白F—G在昆蟲(chóng)細(xì)胞中有特異性表達(dá)，Ni2+離子親和層析柱能夠很好的吸附重組目的蛋白。結(jié)論成功克隆了RSV F—G融合表位基因，并在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中獲得表達(dá)。Ni2+離子親和層析法純化目的蛋白