兔肝輔酶Ⅱ依賴性視黃醛還原酶的分離純化、性質(zhì)鑒定及全長cDNA的克隆.pdf

1、維生素A類物質(zhì)(retinoids)在哺乳動物眾多的生理功能中起著重要的作用,這些物質(zhì)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的失衡可能會導(dǎo)致疾病的發(fā)生。細胞內(nèi)維生素A類物質(zhì)的穩(wěn)態(tài)受飲食、體內(nèi)相關(guān)代謝酶等多方面的嚴格調(diào)控,但是相關(guān)酶類調(diào)控類維生素A代謝的機制到現(xiàn)在仍然沒有完全闡明。
　　黃東陽教授(DY Huang and Y Ichikawa. Biochim Biophys Acta, Mar1997;1338(1):47-59)曾報道從兔肝細胞質(zhì)溶膠純化化

2、了一個亞基分子量為34kDa、表觀分子量為144kDa的輔酶 II依賴性的視黃醇脫氫/視黃醛還原酶(NRDR)。Genbank中登陸號為AB045133的cDNA被認為是NRDR的編碼基因,它被注釋為化物酶體蛋白并執(zhí)行輔酶II依賴性的視黃醇脫氫或者視黃醛還原的功能。進一步分析發(fā)現(xiàn)Genbank中cDNA序列推導(dǎo)出來的蛋白的分子量約為27.4kDa,與純化的NRDR蛋白有些差異,而且他們的N端序列并不完全一致。另外,我們發(fā)現(xiàn)和兔NRDR基

3、因同源的小鼠和人的基因在相同的讀碼框架內(nèi)有兩個起始密碼。兔NRDR基因是不是也應(yīng)該又類似的結(jié)構(gòu)?對于究竟哪個是天然蛋白真正的起始點的問題其他的一些相關(guān)研究的學(xué)者也還存在爭論。由此我們推斷最大可能是天然生理狀態(tài)的NRDR蛋白可能是經(jīng)過了有趣的翻譯后修飾、加工的產(chǎn)物;另一種很小的可能性是NRDR的編碼基因和前述的AB045133序列不同。
　　我們先運用 RACE(cDNA末端快速擴增法)方法成功的獲得了全長的目的cDNA。通過序列的

4、分析我們發(fā)現(xiàn)在同一個讀碼框架內(nèi)它的5’末端也有兩個起始密碼。我們發(fā)現(xiàn)視黃醛還原活性存在于兔肝勻漿分級離心得到的的細胞質(zhì)溶膠組分當中而不存在于含有過氧化物酶體的細胞器組分。隨后通過連續(xù)的層析,包括離子交換層析、疏水層析、親和層析和分子篩層析步驟,我們得到了高純度的有功能的天然蛋白。SDS-PAGE分析顯示該蛋白的表觀分子量為28kDa;質(zhì)譜精確測定確定其分子量為27.4kDa;進一步的分子篩層析確定其分子量為63kDa。運用N端測序、肽指