杏鮑茹(Pleurotus ervngii)漆酶基因的體外誘變及在畢赤酵母中表達.pdf

1、漆酶屬于銅藍氧化酶,是一種重要的木質素降解酶,參與自然界木質素的循環(huán)和利用,同時漆酶對與木質素結構相似的許多環(huán)境污染物也有明顯的降解能力,因此漆酶在環(huán)境保護、造紙工業(yè)、食品工業(yè)、及生物傳感器、免疫檢測等領域的重要性越來越明顯。漆酶在自然界中主要是白腐菌產生的,但白腐菌產漆酶的能力較低,很難滿足工業(yè)發(fā)酵的需求。杏鮑菇是從常見白腐菌中篩選出來的,其最適作用溫度較高且熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性也比較好。本課題以杏鮑菇組成型漆酶的cDNA序列(Ge

2、nBank序列號為FJ231091)為材料,即pMD19T-lac為模板,運用易錯PCR和重疊延伸PCR對漆酶基因進行體外誘變,獲得突變基因,并構建了重組克隆載體和重組表達載體,用于研究漆酶的異源表達情況,實現(xiàn)漆酶的高密度發(fā)酵和縮短漆酶的生產周期。為工業(yè)化生產打下良好的基礎,并為將來對漆酶進行進一步分子改造以及快速定向進化奠定基礎。論文共分三個部分。
　　 1.以來自杏鮑菇的漆酶基因(pMD19T-lac)為模板,采用易錯PCR

3、(error-prone PCR)對漆酶基因進行體外誘變,建立突變庫,篩選突變基因,構建畢赤酵母表達系統(tǒng),但未見活性表達。隨機挑選突變體測序,結果表明,其中一個突變基因共有兩個堿基發(fā)生了突變,均發(fā)生在T、C之間,其中第209位Val→Ala,另一個為第237位Pro的同義突變。這兩個位點分別處于結構域1的1個β-折疊片和一段無規(guī)卷曲上,參與和T2/T3三核簇的連接。
　　 2.以易錯PCR篩選到的突變體基因為模板,用疊延伸PCR

4、法(OE—PCR)將GCC回復突變?yōu)楦弑磉_優(yōu)越密碼子GTC,即實現(xiàn)了Ala→Val。含突變位點的基因(lacM)與pMD19T-Simple Vector連接,構建為重組克隆載體pMD19-lacM。
　　 3.含突變位點的基因(lacM)與畢赤酵母分泌型表達載體pHBM905A連接,構建為重組表達載體pHBM905AM,線性化后電轉化進畢赤酵母GS115,利用釀酒酵母α-factor作為信號肽,在GS115中誘導表達成功。雖檢