內切幾丁質酶全基因合成及其在畢赤酵母中表達和發(fā)酵條件優(yōu)化的研究.pdf

1、幾丁質是由N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc)通過β-1,4-糖苷鍵連接而成的高分子聚合物,是僅次于纖維素的第二大可再生資源。幾丁質的中間降解產物幾丁寡糖是一種具有獨特生理活性的功能性低聚糖,分子量小、溶解性好、易于吸收的特性使其在生物醫(yī)藥、食品、化妝品、紡織、農業(yè)等各領域都有廣泛的應用價值。但傳統(tǒng)工藝應用酸堿法來提取制備幾丁質相關產品,容易造成較為嚴重的環(huán)境污染。因此,研究開發(fā)合適的、沒有污染的生

2、物酶法降解幾丁質的生產工藝,以代替?zhèn)鹘y(tǒng)工藝制備幾丁寡糖及N-乙酰葡萄糖胺,以及合成新幾丁質酶基因并構建高效表達工程菌等,已是一個迫在眉睫的并具有重大經濟價值與理論價值的研究課題。
　　 本研究采用Successive PCR技術,合成了基于巴斯德畢赤酵母的偏愛性的內切幾丁質酶基因序列SECH,將該基因序列克隆至載體pPIC9K中,得到真核表達載體pPIC9K-SECH,通過線性化及電擊法轉化至巴斯德畢赤酵母中,再根據生長情況快速

3、篩選出G418抗性較高的陽性克隆轉化子ZJGSU04,用DNS法測定了重組菌產生的內切幾丁質酶活力,并通過SDS-PAGE對該基因表達的蛋白產物進行了分析。在此基礎上利用部分因子實驗(FFD)及響應面實驗初步優(yōu)化了重組菌的產酶條件。本研究主要取得了以下結果:
　　 1.根據巴斯德畢赤酵母密碼子的偏愛性和內切幾丁質酶的基因序列,設計14對引物,采用Successive PCR技術合成一段大小為1185bp的DNA片段,通過序列對比

4、后發(fā)現(xiàn)合成的內切幾丁質酶基因與本實驗室前期克隆獲得的綠色木霉內切幾丁質酶基因序列不同,但是氨基酸序列沒有變化,說明成功合成了基于巴斯德畢赤酵母密碼子偏愛性的內切幾丁質酶基因序列。
　　 2.用EcoRI和NotI分別雙酶切內切幾丁質酶基因SECH和pPIC9K質粒DNA,用T4DNA連接酶連接回收的目的條帶,得到真核表達載體pSECH,用CaCl2法將其轉化到大腸桿菌DH5α。利用Kana抗性篩選單菌落。所選轉化克隆經PCR、酶

5、切鑒定和DNA測序測定證明克隆正確,從而獲得了重組質粒pPIC9K-SECH。
　　 3.將重組質粒pPIC9K-SECH經Bpu1102I線性化處理并電擊轉化巴斯德畢赤酵母GS115,通過G418加壓篩選獲得了能夠高效表達內切幾丁質酶的轉化子ZJGSU04。通過DNS法測定內切幾丁質酶活為23.09 U/mL,SDS-PAGE及酶譜分析證明內切幾丁質酶成功的獲得了表達,分子量約為43kDa。
　　 4.使用單因素實驗研

6、究了甲醇、油酸、Tween-80、PTM1以及pH值對重組內切幾丁質酶表達量的影響。單因素結果表明:甲醇的最佳誘導濃度為0.5％;添加0.05％的油酸、0.3％的Tween-80、0.8％的PTM1明顯有利于重組內切幾丁質酶的表達;酸性或堿性環(huán)境不利于重組內切幾丁質酶的表達,應將培養(yǎng)基pH值維持在6.0左右。在此基礎上,通過Fractional Factorial Design(FFD)實驗設計,確定了甲醇、油酸和Tween-80是影響

7、重組酵母表達內切幾丁質酶的關鍵因素,并選取甲醇、油酸和Tween-80三個因素進行了響應面實驗設計。通過Design-expert7.0軟件進行了設計和分析,得到發(fā)酵生產重組內切幾丁質酶的最佳誘導培養(yǎng)基配方為:1.00％酵母膏、2.00％蛋白胨、1.34％YNB、100 mM磷酸緩沖液(pH6.0)、0.71％甲醇、0.086％油酸、0.31％Tween-80、0.80％PTM1、4.00×10-5％生物素。在最佳培養(yǎng)條件下,經誘導培養(yǎng)