色素熒光蛋白基因的克隆及在畢赤酵母中表達.pdf

1、綠色熒光蛋白(GFP)具有優(yōu)異的熒光活性，作為報告基因與靶蛋白融合，示蹤靶蛋白在活細胞內(nèi)的位置、移動及相互作用。藍細菌中的色素蛋白具有豐富的光譜范圍，可彌補綠色熒光蛋白光譜的不足，拓展熒光蛋白標簽在細胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用。綠色熒光蛋白與色素蛋白的融合進一步拓寬光譜的檢測范圍，能用作二色、多色標記，可作熒光探針用于定位。另外，藍細菌中色素蛋白潛在的生物活性也引起人們的重視，如作為光敏劑和抗氧化活性用于光動力學(xué)治療。
　　 本文研究

2、包括以下幾個方面：
　　 (1)綠色熒光蛋白肌動蛋白融合基因的克隆與在原核表達系統(tǒng)中表達。首先從大腸桿菌中克隆出肌動蛋白基因mreB，與gfp基因融合，構(gòu)建質(zhì)粒pCDFDuet-mreB：gfp，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，經(jīng)熒光顯微鏡圖像、熒光和吸收光譜特征以及蛋白質(zhì)電泳結(jié)果證明融合基因在大腸桿菌中表達。
　　 (2)綠色熒光蛋白和膽綠素還原酶基因pcyA在畢赤酵母菌株GS115中表達。首先構(gòu)建酵母質(zhì)粒pPICZB-gfp和pPIC

3、ZB-gfp：pcyA，以電轉(zhuǎn)化方式分別導(dǎo)入巴斯德酵母菌株GS115基因組中，篩選陽性克隆子，進行誘導(dǎo)表達。由熒光顯微鏡圖像，熒光和吸收光譜特征以及蛋白質(zhì)電泳結(jié)果證明gfp基因和gfp：pcyA融合基因在酵母中表達成功，初步建立畢赤酵母表達系統(tǒng)，構(gòu)建出外源蛋白的酵母表達平臺。
　　 (3)畢赤酵母雙色熒光蛋白表達體系的構(gòu)建。首先克隆出酵母線粒體膜蛋白基因f0并與gfp(△SacI)：pcyA基因融合，構(gòu)建酵母表達質(zhì)粒pPIC3.

4、5K：f0：gfP(△SacI)：pcyA，以電轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入菌株GS115基因組中，得到的陽性克隆子誘導(dǎo)表達。通過熒光顯微鏡圖像、熒光和吸收光譜特征篩選出工程菌GS115/pPIC3.5K：f0：gfp(△SacI)：pcyA。然后構(gòu)建含GAF3結(jié)構(gòu)域的光敏色素酵母質(zhì)粒 pPICZB：abp1：gaf3：ho1，同樣以電轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入工程菌GS115/pPIC3.5K：f0：gfp(△SacI)：pcyA基因組中。經(jīng)PCR篩選的陽性克隆子