基于Cre-LoxP系統(tǒng)tTA轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建及應(yīng)用.pdf

1、腫瘤對(duì)人類生命和健康造成了重大威脅，而轉(zhuǎn)基因小鼠已成為研究各種腫瘤形成機(jī)制的有力工具。聯(lián)合應(yīng)用四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)和Cre/LoxP系統(tǒng)的高效且無毒的誘導(dǎo)基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)是近年來發(fā)展起來的。其應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因小鼠上，實(shí)現(xiàn)了對(duì)外源基因時(shí)空表達(dá)的可控，使得小鼠腫瘤模型更接近實(shí)際情況,更高效地解析腫瘤的發(fā)生機(jī)制。人類腫瘤中最常見的癌基因異常是ras基因突變,其中對(duì)人類影響較大的是K-ras基因突變。
　　為深入研究K-ras基因突變致癌的發(fā)生機(jī)制

2、，以期達(dá)到治療腫瘤的目的，需精確調(diào)控K-ras突變基因的時(shí)空表達(dá)，建立合適的腫瘤模型。在實(shí)驗(yàn)室已有的四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)的反應(yīng)元件TRE-Kras-G12D小鼠前提下，需要再構(gòu)建調(diào)控元件轉(zhuǎn)基因小鼠，通過這兩種小鼠交配所得雙陽性小鼠，誘導(dǎo)Kras G12D蛋白的表達(dá)。而本文的主要工作就是基于 Cre/LoxP和四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)原理，構(gòu)建出可潛在高表達(dá)tTA蛋白的CL-tTA轉(zhuǎn)基因小鼠，可作為實(shí)驗(yàn)室的轉(zhuǎn)基因工具鼠，為構(gòu)建不同癌基因腫瘤模型打下基礎(chǔ)。

3、
　　本文主要是通過分子生物學(xué)常用技術(shù)構(gòu)建pClkhl-tTA-IRES-GFP重組質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)ES細(xì)胞，用潮霉素B和他莫昔芬篩選出高表達(dá)的ES細(xì)胞，進(jìn)行拷貝數(shù)和細(xì)胞水平tTA功能鑒定，囊胚注射，獲得嵌合體小鼠。嵌合體小鼠與FVB小鼠交配，所得子代經(jīng)PCR初步鑒定，可獲得CL-tTA陽性小鼠。下面進(jìn)一步鑒定陽性小鼠的拷貝數(shù)，以及在細(xì)胞水平上證明tTA調(diào)控功能。然后將制備好的CL-tTA陽性小鼠與實(shí)驗(yàn)室中的TRE-Kras-G12D小

4、鼠交配，獲得雙陽性小鼠。最后分別對(duì)一部分小鼠進(jìn)行鼻腔注射Adeno-cre病毒，另一部分進(jìn)行皮內(nèi)注射Adeno-cre病毒，三個(gè)月后進(jìn)行解剖，取組織進(jìn)行 HE染色觀察是否形成腫瘤。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，成功構(gòu)建了單拷貝高表達(dá)的CL-tTA轉(zhuǎn)基因小鼠，與TRE-Kras-G12D小鼠交配后獲得雙陽性小鼠，經(jīng) Adeno-cre病毒鼻腔注射和皮內(nèi)注射，三個(gè)月后很好地誘導(dǎo)了皮膚腫瘤，而肺組織也出現(xiàn)異常。在這里CL-tTA轉(zhuǎn)基因小鼠潛在高表