微流控芯片高效捕獲乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及再培養(yǎng)研究.pdf

1、近年來，乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率高，大多與抑癌基因發(fā)生基因突變密切相關(guān)，從而導(dǎo)致正常細(xì)胞癌變。惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移是癌癥患者病情復(fù)發(fā)或者死亡的主要原因。傳統(tǒng)的用于檢測腫瘤的方法如血清腫瘤標(biāo)志物和影像學(xué)診斷對腫瘤發(fā)生早期的檢出率均較低，所以有效地檢測腫瘤早期的微小轉(zhuǎn)移一直是臨床醫(yī)學(xué)面臨的挑戰(zhàn)。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)是存在于很多腫瘤患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，它由原發(fā)灶脫落后進(jìn)入人體循環(huán)或淋

2、巴系統(tǒng)，并通過外周血轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)端的組織或者器官甚至遍布全身。循環(huán)腫瘤細(xì)胞具有上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和一些腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性，所以在循環(huán)系統(tǒng)中能夠進(jìn)入血管、快速增殖并形成轉(zhuǎn)移瘤。很多研究都表明循環(huán)腫瘤細(xì)胞的遷移、粘附等與癌癥的轉(zhuǎn)移和預(yù)后復(fù)發(fā)均有密切關(guān)系。所以，循環(huán)腫瘤細(xì)胞具有很重要的臨床意義，對早期診斷、預(yù)后判斷、療效檢測和靶向藥物的開發(fā)等提供理論基礎(chǔ)。在全血中的循環(huán)腫

3、瘤細(xì)胞與血細(xì)胞數(shù)相比極少，對其進(jìn)行分離、檢測和純化仍具有一定的挑戰(zhàn)性。目前主要依據(jù)腫瘤細(xì)胞的大小、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞密度和腫瘤細(xì)胞獨特的生物學(xué)特性對循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分離，包括過濾法、密度梯度離心法、細(xì)胞表面電荷法和免疫磁珠法等。對循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測主要從細(xì)胞計數(shù)和核酸表達(dá)分析兩個方面進(jìn)行。研究者一直致力于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集、檢測和純化技術(shù)的研究，希望能夠找到高效捕獲腫瘤細(xì)胞的方法并將其應(yīng)用于臨床檢測。微流控芯片是近幾年飛速發(fā)展的一種對CTC

4、s進(jìn)行快速檢測和操控的技術(shù)。它具有可控的單元集成模式和微尺度結(jié)構(gòu)，可實現(xiàn)樣品處理、捕獲和檢測一體化，降低試劑和樣品量的消耗，能實現(xiàn)快速、高效、高通量的分析，獲得更多有關(guān)CTCs的信息。MUC1是一類高分子糖蛋白，正常細(xì)胞中低表達(dá)，在癌細(xì)胞和癌組織中高表達(dá)并以畸形糖基化和糖基化不完全兩種形態(tài)存在，從而使抗原分布在癌細(xì)胞表面，可被特異性抗體識別。MUC1與腺癌特別是乳腺癌的癌細(xì)胞惡變、轉(zhuǎn)移和浸潤密切相關(guān)，其表達(dá)與乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移也具有相

5、關(guān)性。
　　本研究利用微流控芯片作為載體，通過對芯片基底表面進(jìn)行MUC1抗體修飾，利用抗原與抗體相結(jié)合的方法，實現(xiàn)了對人乳腺腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231的特異性捕獲和研究。乳腺腫瘤細(xì)胞捕獲的條件和環(huán)境嚴(yán)重影響了癌細(xì)胞捕獲效率，因此篩選和優(yōu)化捕獲條件對于提高細(xì)胞捕獲率很有必要。實驗中從微流控基底表面的粗糙度、微流控孔道的花紋、抗體孵育時間、細(xì)胞樣品注入流速、細(xì)胞注入芯片后在通道內(nèi)停滯的時間等方面進(jìn)行捕獲條件優(yōu)化，結(jié)果獲得了較高的細(xì)胞

6、捕獲率。捕獲后的乳腺癌細(xì)胞經(jīng)過分離和再培養(yǎng)，進(jìn)一步利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-PCR)分別分析芯片捕獲是否影響乳腺癌細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)水平變化。同時對抗腫瘤藥物阿霉素(Doxorubicin)處理的正常和再培養(yǎng)的人類乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中FN1、RUNX2、1TGA6MMP3、LAMB3和ERBB2基因表達(dá)進(jìn)行相對定量分析。實驗結(jié)果證明，利用微流控芯片能有效富集腫瘤細(xì)胞，捕獲前后細(xì)胞內(nèi)