大腸桿菌中新型膠原蛋白融合表達(dá)多種生長(zhǎng)因子的研究.pdf

1、類膠原蛋白Scl2是一類含有高度重復(fù)氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其構(gòu)象為穩(wěn)定的三股螺旋結(jié)構(gòu)，能夠抵抗多種蛋白酶的降解，可利用酸法沉淀和酶法水解快速獲得較純的Scl2，因此將Scl2作為融合標(biāo)簽，在融合蛋白的純化方面有一定的優(yōu)勢(shì)。Scl2-M是在Scl2的序列上整合了一些功能位點(diǎn)，該蛋白在大腸桿菌中可溶表達(dá)量較高。
　　人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(human basic fibroblase growth factor，hbFGF)對(duì)于臨床醫(yī)

2、學(xué)有很高的價(jià)值，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞增殖分化，加速骨組織發(fā)育，保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等。隨著對(duì)hbFGF研究和應(yīng)用的拓展，越來越多的醫(yī)療、美容等機(jī)構(gòu)開始將hbFGF用于神經(jīng)系統(tǒng)、燒傷、疾病的治療以及化妝品中，展現(xiàn)了廣闊的市場(chǎng)前景。
　　目前，hbFGF制劑昂貴，無(wú)法滿足大規(guī)模的應(yīng)用需求。hbFGF的制備主要通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組表達(dá)，但由于hbFGF基因中的某些密碼子是稀有密碼子，導(dǎo)致非融合的hbFGF在大腸桿菌中表達(dá)量不高，且極易被蛋白酶降

3、解。此外，hbFGF的氨基酸序列上存在四個(gè)Cys殘基，在溶液中極易形成分子間的二硫鍵，導(dǎo)致二聚體甚至是多聚體的形成，造成hbFGF生物活性的喪失。
　　本文首先依據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性合成了hbFGF的基因模版pUC19-hbFGF，通過PCR擴(kuò)增獲得hbFGF基因。利用類膠原蛋白Scl2在分離純化方面的優(yōu)勢(shì)，以及Scl2-M的高可溶表達(dá)量，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a-Scl2-M-hbFGF，以E.coli BL21(DE3)

4、作為表達(dá)載體，在搖瓶中對(duì)重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的表達(dá)條件為:在TB培養(yǎng)基中，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期加入0.1 mM IPTG，在30C下誘導(dǎo)表達(dá)10h。在該條件下，融合蛋白Scl2-M-hbFGF的可溶表達(dá)量為0.85g/L。
　　利用甲醇誘導(dǎo)畢赤酵母GS115-EK胞外表達(dá)具有生物活性的腸激酶輕鏈，為后續(xù)分離純化提供酶切工具。
　　利用Scl2的特性，通過pH沉淀法純化融合蛋白Scl2-M-hbFGF，其蛋白回收率

5、(＞90％)較Ni2+親和層析純化（約50％）有較大提高。再經(jīng)過腸激酶酶切、陽(yáng)離子交換層析純化，得到高純度的hbFGF，純度可達(dá)90％以上。經(jīng)成纖維細(xì)胞NIH/3T3測(cè)定，所得hbFGF具有生物活性，其促進(jìn)細(xì)胞增殖的活性與陰性對(duì)照相比，細(xì)胞數(shù)量提升約50％。
　　以甘油作為碳源，分別通過分批發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵的方式，在5L發(fā)酵罐上對(duì)大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-Scl2-M-hbFGF進(jìn)行高密度培養(yǎng)。補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)量略