TAT-BDNF融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)及其純化.pdf

1、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brainderivedneuotrophicfactor，BDNF)是1982年德國神經(jīng)生物學(xué)家Barde等從豬腦中分離出來的小分子蛋白質(zhì)，是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中最具代表性的成員之一。BDNF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，對神經(jīng)元的生存、分化、生長起重要作用，同時又維持著神經(jīng)系統(tǒng)的生存和功能，并促進(jìn)損傷后神經(jīng)元的再生。當(dāng)腦缺血后，機(jī)體在沒有外來因素干預(yù)下，內(nèi)源性BDNF可通過自身代償調(diào)節(jié)，提高神經(jīng)元抵抗缺血的能力，促進(jìn)受

2、損神經(jīng)元的修復(fù)、再生，調(diào)節(jié)神經(jīng)結(jié)構(gòu)的重建，促進(jìn)腦損傷后認(rèn)知功能的恢復(fù)。但機(jī)體自身的代償能力有限，持續(xù)時間較短，隨著腦缺血時間的延長，內(nèi)源性BDNF表達(dá)逐漸降低，由于神經(jīng)細(xì)胞損傷后的修復(fù)過程及其后的生長必須經(jīng)歷較長時間，內(nèi)源性BDNF及其受體酪氨酸激酶受體(trkB)的上調(diào)尚不足以防治腦缺血性損傷及其以后的細(xì)胞死亡。大量實驗表明外源性BDNF具有同樣的功能活性。應(yīng)用外源性BDNF給藥到達(dá)大腦發(fā)揮生物學(xué)功能將是治療缺血性腦損傷的一個很有潛力

3、的治療方法。 然而由于血腦屏障(blood-brainbarrier，BBB)的存在，限制了大分子物質(zhì)在血液和腦組織之間的自由交換，許多有治療作用的化學(xué)藥物、多肽和蛋白質(zhì)包括BDNF及核酸類分子難以透過血腦屏障。 目前，國內(nèi)外還沒有能靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生物大分子藥物制劑。在動物實驗研究中，可用局部注射給藥或腦靶向免疫脂質(zhì)體等方法將BDNF等生物大分子帶過血腦屏障并發(fā)揮其生物功能。 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(Proteintra

4、nsductiondomain,PTD)是一類可使生物大分子穿過細(xì)胞膜進(jìn)入胞漿內(nèi)發(fā)揮功能作用的寡肽。將PTD與蛋白質(zhì)、多肽或DNA等分子共價連接后，PTD可將這些分子以一種不依賴受體和膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(transporter)的方式導(dǎo)入細(xì)胞。來源于HIV的TatPTD就是一種轉(zhuǎn)導(dǎo)能力很強(qiáng)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(本研究中簡稱TAT)。實驗證明TatPTD介導(dǎo)的蛋白可以導(dǎo)入近乎所有的細(xì)胞，包括破骨細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞及原代細(xì)胞等常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，甚至

5、還可以穿過血腦屏障，其轉(zhuǎn)導(dǎo)過程不需要能量。因此，TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)被認(rèn)為是一種很有前途的運(yùn)載工具，無論對于基礎(chǔ)研究還是臨床治療，都有著非常廣泛的應(yīng)用前景。 為了探索應(yīng)用TAT將腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子帶過血腦屏障到達(dá)腦實質(zhì)而發(fā)揮其生物效能的可行性，本研究中利用PCR方法將編碼TAT轉(zhuǎn)導(dǎo)域的cDNA連接到編碼成熟BDNF蛋白cDNA的3’端，亞克隆該DNA片段于原核表達(dá)載體pET-30a(+)，得到pET-BDNF-TAT表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)

6、行了酶切和DNA測序鑒定。為了進(jìn)行對比研究和得到不含載體序列的表達(dá)蛋白，在本課題中還構(gòu)建了pET-proBDNF-TAT，pET-BDNF和pET-BDNFTAT。其中pET-BDNF-TAT和pET-BDNF被轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21(DE3)LysS，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后用親和層析的方法純化得到了表達(dá)蛋白。表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE及Westernblot方法進(jìn)行了分析鑒定。 目的： 1.構(gòu)建能表達(dá)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(

7、BDNF)-TAT、不含TAT的成熟區(qū)BDNF，前體proBDNF-TAT，及不含載體序列BDNFTAT等蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。 2.表達(dá)及純化BDNF-TAT融合蛋白及對照BDNF蛋白。 3.對純化得到的蛋白進(jìn)行鑒定。 方法： 1.根據(jù)Genbank中成熟區(qū)BDNF和TAT基因序列，分別設(shè)計克隆編碼BDNF-TAT，BDNF，proBDNF-TAT,BDNFTAT蛋白的cDNA引物，以全長人BDNFcDNA為

8、模板，PCR得到目的基因片段； 2.PCR產(chǎn)物與大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)載體分別雙酶切后，用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，耐藥性標(biāo)記粗篩并挑取陽性克隆，在宿主菌中擴(kuò)增并提取重組質(zhì)粒，采用限制性內(nèi)切酶酶譜和DNA測序兩種方法分析鑒定； 3.將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)LysS中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，得到的包涵體蛋白用8M尿素(pH8.0)裂解液裂解，在變性條件下，用超聲波破碎細(xì)胞，高速

9、離心取上清液后，以Ni-NTA-agarose進(jìn)行梯度洗脫純化和PD-10脫鹽柱進(jìn)行濃縮脫鹽，得到所需純化的目的蛋白； 4.對純化得到的重組蛋白用考馬斯亮藍(lán)染色，抗His-tag和抗BDNF抗體的Westernblotting進(jìn)行鑒定，定量后冷凍干燥并低溫保存。 結(jié)果： 1.經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析和DNA測序證實，本研究構(gòu)建的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒有：pET-BDNF-TAT，pET-BDNF，pET-proBDN

10、F-TAT，pET-BDNFTAT。 2.經(jīng)Ni-NTA-agarose親和層析，純化得到了BDNF-TAT融合蛋白和基因重組BDNF蛋白。 3.BDNF-TAT融合蛋白的分子量約為22kD，基因重組BDNF蛋白的分子量約為18kD。Westernblotting證實所純化蛋白為構(gòu)建表達(dá)的目的蛋白。 結(jié)論： 1.本課題成功構(gòu)建了能表達(dá)BDNF-TAT融合蛋白、基因重組BDNF蛋白的大腸桿菌表達(dá)載體；