甜蛋白Monellin在大腸桿菌中的高效表達.pdf

1、本研究設(shè)計單鏈monellin 基因，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)，構(gòu)建高表達的Monellin 重組大腸桿菌工程菌，從而提高Monellin 的穩(wěn)定性；并用乳糖代替IPTG 作為誘導(dǎo)劑，以降低生產(chǎn)成本。同時對兩種載體（pET22b 和pET28a）構(gòu)成的大腸桿菌表達系統(tǒng)的表達效果進行了比較。 1.根據(jù)monellin 基因的序列，按照Coden Usage Database 數(shù)據(jù)庫（NCBI-GenBank）中大腸桿菌密碼子的偏愛性，

2、人工設(shè)計并合成monellin基因。并在合成基因的5’端添加NcoⅠ酶切位點，在基因的3’端添加BamHⅠ酶切位點，將合成好的全基因通過NcoⅠ/BamHⅠ位點克隆到pET22b載體上。構(gòu)建重組載體pET22b-Mon，將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），得到表達monellin的大腸桿菌工程菌株DE3-pET22b-Mon。再用NcoⅠ、BamHⅠ從含甜蛋白monellin基因的pET22b上切下monellin基因，并將其插入

3、到pET28a 的NcoⅠ、BamHⅠ位點之間，構(gòu)建重組載體pET28a-Mon，將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），得到表達Monellin的大腸桿菌工程菌株DE3-pET28a-Mon。 2.以搖瓶發(fā)酵為基礎(chǔ)，探討了不同載體構(gòu)成的大腸桿菌工程菌在異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)下的表達，研究了誘導(dǎo)起始生長量、誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)培養(yǎng)時長及接種量對目的蛋白表達的影響。 對于大腸桿菌工程菌株DE3-pET

4、22b-Mon，其誘導(dǎo)優(yōu)化條件如下：在裝液量為20mL/100mL搖瓶中，按1％的接種量接種，當(dāng)OD600值達到0.73 時，添加誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1.0mmol/L，37℃繼續(xù)培養(yǎng)6h后，Monellin的表達量達到細菌總蛋白的22.26％。 對于大腸桿菌工程菌株DE3-pET28a-Mon，其誘導(dǎo)優(yōu)化條件如下：在裝液量為20mL/100mL搖瓶中，按1％的接種量接種，當(dāng)OD600值達到1.0 時，添加誘導(dǎo)劑IPTG至終

5、濃度為1.0mmol/L，37℃繼續(xù)培養(yǎng)6h后，Monellin的表達量高達細菌總蛋白的34.08％。 3.以搖瓶發(fā)酵為基礎(chǔ)，探討了不同載體構(gòu)成的大腸桿菌工程菌在乳糖誘導(dǎo)下的表達，研究了誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)起始生長量、誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)培養(yǎng)時長及接種量對目的蛋白表達的影響。 對于大腸桿菌工程菌株DE3-pET22b-Mon，其誘導(dǎo)優(yōu)化條件如下：在裝液量為20mL/100mL搖瓶中，按3％的接種量接種，當(dāng)OD600值達到1.0

6、 時，添加誘導(dǎo)劑乳糖至終濃度為10g/L，37℃繼續(xù)培養(yǎng)7h后，Monellin的表達量占細菌總蛋白的19.86％。 對于大腸桿菌工程菌株DE3-pET28a-Mon，其誘導(dǎo)優(yōu)化條件如下：在裝液量為20mL/100mL搖瓶中，按3％的接種量接種，當(dāng)OD600值達到1.0 時，添加誘導(dǎo)劑乳糖至終濃度為11g/L，37℃繼續(xù)培養(yǎng)8h后，Monellin的表達量占細菌總蛋白的33.09％。 4.在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上，以DE3-p