大腸桿菌外膜蛋白F的表達(dá)與鑒定.pdf

1、在醫(yī)藥領(lǐng)域,抗菌藥物的發(fā)現(xiàn)與使用是20世紀(jì)人類最偉大的成就之一,其后隨著研究者們對(duì)抗菌藥物的深入研究以及各種化學(xué)合成技術(shù)的發(fā)展,抗菌藥物的種類也得到的快速的增加和變得多樣化。如果說(shuō)人類利用各種結(jié)構(gòu)的抗菌藥物對(duì)不同或相同種屬的感染細(xì)菌進(jìn)行殺滅或抑制作用是人類對(duì)感染病菌的第一次征服的話,那么由于抗生素的不合理使用而導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性的事實(shí)將是人類目前所需面臨得對(duì)病原菌的第二次征服之戰(zhàn)。為了獲得第二次“戰(zhàn)爭(zhēng)”的勝利,必須首先清楚地了解細(xì)菌對(duì)各種

2、抗菌藥物的耐藥機(jī)制,針對(duì)各種耐藥機(jī)制尋找新的藥物作用靶標(biāo)并研制開(kāi)發(fā)出療效更好的藥物。在了解了細(xì)菌對(duì)抗生素的各種耐藥機(jī)制后發(fā)現(xiàn),幾乎都有蛋白質(zhì)的參與,如外排泵系統(tǒng)、細(xì)胞膜滲透性的變化、核糖體保護(hù)蛋白、藥物滅活酶等,可見(jiàn)蛋白質(zhì)在細(xì)菌的耐藥中有著舉足輕重的作用。目前研究最多的蛋白質(zhì)是與細(xì)菌外膜滲透性變化相關(guān)的蛋白質(zhì)。外膜結(jié)構(gòu)是革蘭陰性細(xì)菌所特有的結(jié)構(gòu),因此與革蘭陽(yáng)性菌相比,在其他耐藥機(jī)制相似的前提下,還有外膜的屏障作用,使得革蘭陰性菌比陽(yáng)性菌

3、更易耐受藥物的作用。因此,對(duì)革蘭陰性細(xì)菌外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)的研究也最多。大腸埃希氏菌作為臨床常見(jiàn)的條件致病菌,也是典型的革蘭陰性細(xì)菌,與其耐藥機(jī)制中相關(guān)的外膜蛋白有OmpC,OmpF,PhoE,LamB和蛋白K。本實(shí)驗(yàn)選擇大腸桿菌的外膜蛋白中的一種-外膜蛋白F(OmpF)進(jìn)行進(jìn)一步研究,以期為后續(xù)與之同源或結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)在細(xì)菌耐藥方面的研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 本研究首先利用NCB

4、I數(shù)據(jù)庫(kù)和Premier Primer5.0軟件設(shè)計(jì)出合適的PCR引物,通過(guò)PCR技術(shù),以大腸桿菌基因組DNA為模板,擴(kuò)增大腸桿菌外膜蛋白F基因序列,用NcoI和XhoI對(duì)目的基因片段進(jìn)行雙酶切,經(jīng)過(guò)純化處理后的酶切產(chǎn)物,與pET-28c(+)載體進(jìn)行連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入克隆型大腸桿菌宿主細(xì)胞Top10,通過(guò)抗性篩選和酶切鑒定的方法篩選出陽(yáng)性克隆。重組質(zhì)粒的原核表達(dá)與鑒定將測(cè)序J下確的克隆轉(zhuǎn)化入表達(dá)型大腸桿菌宿主細(xì)胞BL21(DE3),

5、利用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá),取不同時(shí)間的培養(yǎng)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析,確定出最優(yōu)表達(dá)溫度,再在此條件下大量表達(dá)目的蛋白,并利用金屬離子親和層析技術(shù),由帶有六聚組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白與重金屬鎳離子特異性非共價(jià)結(jié)合而純化出目的蛋白,同時(shí)對(duì)純化后的目的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。成功構(gòu)建了原核重組質(zhì)粒pET-OmpF。經(jīng)過(guò)測(cè)序表明,OmpF基因片段全長(zhǎng)1089bp。SDS-PAGE結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)大腸桿菌的誘導(dǎo)溫度為25℃時(shí),目的蛋白的表達(dá)率最高。利

6、用金屬離子親和層析技術(shù)可純化出符合質(zhì)譜檢測(cè)純度要求的蛋白質(zhì),利用MALDI-TOF質(zhì)譜對(duì)目的蛋白進(jìn)行檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)利用pET系列載體-pET-28c(+)載體通過(guò)分子生物學(xué)的方法,將目的蛋白基因插入其中,轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后成功構(gòu)建并表達(dá)出了大腸桿菌外膜蛋白F,同時(shí)鎳離子親和層析柱對(duì)含有組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白進(jìn)行特異性地吸附分離純化作用,為后續(xù)質(zhì)譜的檢測(cè)提供了純度較高的蛋白樣品。通過(guò)MALDI-TOF質(zhì)譜檢測(cè),確定出OmpF的一級(jí)結(jié)構(gòu),為后續(xù)與之