2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(Escherichia Escherichia coli,ETEC)是引起人類和家畜腹瀉的主要病原菌。熱穩(wěn)定腸毒素基因(ST)是其一種毒力單位,介導(dǎo)致病?;魜y弧菌(Vibrio Cholera)是引起霍亂流行的病原茵,曾在世界范圍引起多次大的流行,死亡率很高。霍亂B亞單位無(wú)毒性,但能與大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上的神經(jīng)結(jié)苷脂GM1結(jié)合,含有大部分毒素抗原的決定簇,有很強(qiáng)的抗原性,在霍亂的抗毒免疫中起重要作用。 本文利

2、用 PCR 技術(shù)分別從保存的基因質(zhì)粒中克隆出霍亂毒素 B 亞單位(CTB)和重組熱穩(wěn)定腸毒素基因(mST)。利用重疊PCR技術(shù),通過(guò)Linker將CTB基因和串連的mST連接,得到CTB-mST2的融合基因。將所得到的基因分別插入表達(dá)載體 pET-22b(+)和 PITG-Trx,構(gòu)成表達(dá)載體 pET-CTB-mST2,pET-Trx1/ctb-st2 和 pET- Trx2/ctb-st2。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主菌BL21(DE3)獲得

3、克隆,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得CTB-mST2融合蛋白。經(jīng)超聲破菌和SDS-PAGE電泳分析,目的蛋白的表達(dá)后均以包涵體的形式存在。為了得到目的蛋白的高表達(dá)量,采用多因素正交優(yōu)選法優(yōu)化了培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。多因素正交優(yōu)選法考察了 4個(gè)因素和3個(gè)水平,培養(yǎng)條件從起始誘導(dǎo)菌密度,誘導(dǎo)溫度,IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行考察。最后經(jīng)搖瓶培養(yǎng),在優(yōu)化培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下融合蛋白表達(dá)量可達(dá)320 mg/L,占總蛋白40%。對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行包涵體復(fù)性后,經(jīng)過(guò)親合層

4、析純化得到融合蛋白,純化的融合蛋白CTB-mST2經(jīng)薄層凝膠掃描分析純度大于95%。對(duì)該融合蛋白抗原性和免疫原性進(jìn)行了分析,Western Blotting 表明CTB-mST2能與CTB抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。融合蛋白免疫小鼠,可獲得高滴度抗CTB和ST血清;將融合蛋白與滅活的O157:H7菌體組合免疫小鼠,可產(chǎn)生對(duì)O157:H7毒株攻擊的保護(hù)力,而且呈現(xiàn)出相對(duì)于滅活O157:H7菌體單獨(dú)免疫更強(qiáng)的保護(hù)力。比本項(xiàng)研究為構(gòu)建抗ETEC和EHE

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