體內(nèi)外暴露二乙烯砜生成新DNA加合物的合成、性質(zhì)和鑒定研究.pdf

1、芥子氣（簡(jiǎn)稱SM）即二氯二乙基硫醚，是一種典型的糜爛性化學(xué)戰(zhàn)劑，被禁止化學(xué)武器組織（OPCW）嚴(yán)格控制和禁用。由于其制備簡(jiǎn)單，使用門(mén)檻低，難防難治，極易用于戰(zhàn)爭(zhēng)、恐怖襲擊等，對(duì)人民的健康安全造成了極大地威脅。SM暴露生物體后，具有廣泛的毒性，中毒損傷機(jī)制復(fù)雜，其具體的毒理作用機(jī)制至今還未闡明。目前普遍認(rèn)為DN A烷基化損傷及斷裂是其生物毒性最直接、最重要的始發(fā)機(jī)制。因此，DNA加合物成為SM中毒后最重要的內(nèi)暴露指標(biāo)，是國(guó)內(nèi)外研究SM中毒

2、后體內(nèi)損傷機(jī)制的熱點(diǎn)。
　　課題組前期研究結(jié)果表明，SM暴露后在體內(nèi)迅速發(fā)生氧化反應(yīng)，其中大部分（約90％）轉(zhuǎn)化為芥子亞砜（SMO），SMO會(huì)逐步氧化成芥子砜（SMO2）， SMO2可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為的二乙烯砜（DVS）。已有報(bào)道，DVS屬劇毒分子，其毒性高于SM，并且具有類SM的糜爛性和高反應(yīng)活性。但目前圍繞其開(kāi)展的毒理研究工作較少，有關(guān)DVS的DN A損傷效應(yīng)研究更是尚未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道。
　　本文以SM的重要氧化代謝產(chǎn)物DVS

3、為研究對(duì)象，詳細(xì)研究其與體內(nèi)重要活性分子，包括谷胱甘肽（GSH）、嘌呤、核苷和 DNA等形成加合物的特性和能力，闡述DVS對(duì)機(jī)體造成氧化損傷和基因損傷的分子基礎(chǔ)，進(jìn)而揭示其對(duì)SM系列損傷效應(yīng)的貢獻(xiàn)，回答SM代謝產(chǎn)物是否具有二次損傷效應(yīng)的疑問(wèn)，為溯源芥子氣中毒和開(kāi)展醫(yī)學(xué)干預(yù)提供新思路。
　　主要研究?jī)?nèi)容如下：首先設(shè)計(jì)和優(yōu)化合成路線，制備系列新加合物；進(jìn)而采用 HPLC-MS/MS、NMR等技術(shù)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，在此基礎(chǔ)上建立有效的

4、LC-MS/MS方法，詳細(xì)考察 DVS及其二相代謝產(chǎn)物形成的 DNA加合物在動(dòng)物體內(nèi)各組織的分布情況及時(shí)效關(guān)系，為更準(zhǔn)確闡述SM中毒損傷機(jī)制提供重要理論依據(jù)。
　　第一章為前言。詳細(xì)介紹了SM的相關(guān)理化性質(zhì)及其在體內(nèi)包括氧化水解途徑、結(jié)合途徑在內(nèi)的多種代謝途徑。重點(diǎn)闡述了SM在體內(nèi)的氧化代謝途徑及重要代謝產(chǎn)物DVS的來(lái)源及其毒性和損傷機(jī)制，明確DVS的毒性高于SM且能誘導(dǎo)產(chǎn)生基因毒性，圍繞DVS提出研究目標(biāo)和研究?jī)?nèi)容。
　　

5、第二章是參考品制備和鑒定。以SM為起始原料，經(jīng)過(guò)兩次“串聯(lián)氧化”反應(yīng)和一步“脫氯”反應(yīng)，方便高效的獲得了 DVS。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)底物，簡(jiǎn)化分離純化條件，首次制備了5種新的 DVS-嘌呤加合物和2種GSH-DVS-嘌呤加合物。并采用 HPLC-MS/MS、NMR、HPLC、GC-MS等技術(shù)對(duì)加合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證及純度分析。
　　第三章為體外D VS反應(yīng)特性考察及D VS-DN A加合物檢測(cè)方法建立。在體外溶液中重點(diǎn)考察了DV

6、S與嘌呤堿基（腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤）、脫氧核苷（腺苷、鳥(niǎo)苷）、DN A在近生理?xiàng)l件下形成加合物的特性及機(jī)理，進(jìn)而建立有效的DVS-DN A加合物的LC-MS/MS檢測(cè)方法，完成染毒HaCaT細(xì)胞內(nèi)的DNA加合物的檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，水體系中DVS能與DNA形成五種加合物，具體是N3-HESVA， N7-HESVG，N3-AHESEHG-N7，N7-GHESEHG-N7，N3-AHESEHA-N3。而染毒細(xì)胞內(nèi)僅檢測(cè)到四種DNA加合物并非五種，

7、未檢測(cè)到N3-AHESEHA-N3，從而確證了DVS對(duì)DN A存在損傷效應(yīng)。
　　第四章是D VS染毒動(dòng)物體內(nèi)D VS-DN A加合物的確證及組織分布研究。建立了DV S靜脈染毒S D大鼠模型，在暴露后不同時(shí)間點(diǎn)采集重點(diǎn)臟器組織，如肝、脾、肺、腎、腦等，定量檢測(cè)D VS-DN A加合物的含量分布，考察D VS損傷水平及毒性特點(diǎn)。結(jié)果表明，染毒動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一致，僅檢測(cè)到四種DNA加合物。相比于SM，DVS形成加合物的種類和

8、豐度存在顯著差異，對(duì)臟器的持續(xù)損傷能力更強(qiáng)，部分DN A加合物可在體內(nèi)存在數(shù)天，組織分布不顯著。
　　第五章進(jìn)一步研究了DV S二相代謝產(chǎn)物DVS-GS H與DN A加合反應(yīng)特性。重點(diǎn)考察了DVS與GSH、DVS-GSH與DNA在近生理?xiàng)l件下體外的反應(yīng)加合情況，結(jié)果表明在水溶液中 DVS與 GSH的反應(yīng)活性顯著高于 SM，且生成的DVS-GSH單加合物也具有較高的反應(yīng)活性，可與 DNA的腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤生成系列新的加合物（GSH-D

9、VS-Ade、GSH-DVS-Gua），且前者加合物的豐度比高于后者，因此DVS的二相代謝產(chǎn)物DVS-GS H對(duì)DN A的損傷效應(yīng)也值得關(guān)注。
　　綜上所述，本論文完成SM氧化代謝物DVS系列 DNA加合物參考品的制備，建立了 DVS-DNA加合物的 LC-MS/MS方法，完成染毒細(xì)胞內(nèi) DVS-DNA加合物的鑒定及染毒動(dòng)物體內(nèi)DVS-DN A加合物的組織分布研究，并初步探討了DVS的二相代謝產(chǎn)物（DVS-GSH）對(duì)DNA的損傷效