腫瘤血管靶向肽GX1的體內(nèi)外鑒定.pdf

1、血管生成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的必要條件。腫瘤血管抑制療法已成為目前腫瘤治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。采用腫瘤血管抑制療法，關(guān)鍵是提高腫瘤血管內(nèi)皮的靶向性。研究表明，不同組織的血管具有異質(zhì)性；腫瘤血管也特異性表達(dá)正常血管不表達(dá)或痕量級(jí)表達(dá)的異質(zhì)性分子，而這些分子可作為研究治療的靶點(diǎn)。活體噬菌體肽庫(kù)篩選技術(shù)為我們篩選出選擇性結(jié)合于特定血管靶向受體的小肽提供了一項(xiàng)技術(shù)手段。通過(guò)活體噬菌體篩選技術(shù)，已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤血管內(nèi)皮特異性結(jié)合肽。如：RGD-4C、NGR

2、、CPRECES、GSL基序。
　　GX1是我們利用隨機(jī)噬菌體環(huán)7肽庫(kù)，從人胃低分化腺癌的小鼠腎包膜下異種移植瘤模型體內(nèi)篩選出來(lái)的能夠與人胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合的環(huán)狀9肽。在前期工作中，我們對(duì)GX1進(jìn)行了初步體外鑒定。免疫組化結(jié)果顯示，GX1噬菌體能夠與人胃癌、結(jié)腸癌組織及荷瘤小鼠移植瘤內(nèi)的血管特異性結(jié)合。GX1受體在胃癌中的表達(dá)與其惡性程度相關(guān)，在低分化胃癌組織中的表達(dá)明顯高于高分化和中分化胃癌組織。GX1噬菌體與人臍靜脈內(nèi)

3、皮細(xì)胞的結(jié)合力強(qiáng)于其他腫瘤細(xì)胞。分子模擬顯示其空間結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，可作為抗原結(jié)合表位。目前，該小肽序列已取得國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利。
　　體外鑒定結(jié)果顯示GX1噬菌體能夠與胃癌、結(jié)腸癌內(nèi)血管特異性結(jié)合。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)GX1在腫瘤血管導(dǎo)向治療中的應(yīng)用價(jià)值，需要對(duì)GX1噬菌體表面呈現(xiàn)肽CGNSNPKSC進(jìn)行進(jìn)一步體內(nèi)外鑒定；而一個(gè)新型的噬菌體淘篩小肽是否可作為生物導(dǎo)向分子用于腫瘤血管抑制治療導(dǎo)向性藥物的開(kāi)發(fā)，主要取決于三要素：小肽與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的特

4、異性、與其受體結(jié)合的親和力及活體內(nèi)的腫瘤血管靶向性。本課題將對(duì)此三方面進(jìn)行探討。
　　【目的】
　　1.利用放射性核素標(biāo)記GX1短肽，用放射自顯影、體外受體放射配基結(jié)合分析，結(jié)合噬菌體體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步鑒定GX1與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的特異性，與其受體結(jié)合的親和力；分析GX1與共培養(yǎng)及單純培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的差異，評(píng)價(jià)GX1是否為腫瘤血管內(nèi)皮所特異性結(jié)合分子。
　　2.利用活體示蹤技術(shù),將標(biāo)記肽注入荷瘤小鼠體內(nèi)，研究GX1在體內(nèi)

5、的代謝、分布；從活體水平，利用影像學(xué)方法鑒定GX1是否具有腫瘤血管的靶向性。
　　【方法】
　　1.化學(xué)合成GX1，采用直接標(biāo)記法，利用99TcmO4-標(biāo)記GX1。標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量鑒定，包括放化純度、比活度測(cè)定及穩(wěn)定性分析。分離、培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，利用微觀放射自顯影術(shù)對(duì)99Tcm-GX1進(jìn)行生物學(xué)活性鑒定。
　　2.利用微觀放射自顯影術(shù)、體外受體放射配基結(jié)合分析及競(jìng)爭(zhēng)抑制分析，結(jié)合噬菌體體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析GX1

6、與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的特異性、與其受體結(jié)合的親和力及受體密度；構(gòu)建共培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，分析GX1與共培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及單純培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞親和性的差異。
　　3.構(gòu)建荷人胃癌移植瘤裸鼠模型，將99Tcm-GX1尾靜脈注入荷瘤小鼠體內(nèi)，進(jìn)行生物學(xué)分布研究，驗(yàn)證標(biāo)記肽是否具有腫瘤組織的特異性分布特性。
　　4.將99Tcm-GX1尾靜脈注入荷瘤小鼠體內(nèi)，進(jìn)行ECT顯像，觀察標(biāo)記肽是否具有腫瘤血管靶向性。
　　【結(jié)果】

7、r>　　1.（1）99Tcm直接法標(biāo)記GX1，所得標(biāo)記率在90-98％，比活度大于200Ci/mmol；將99Tcm-GX1室溫下放置，以及與生理鹽水、血清、EDTA、半胱氨酸混合，0-24h各溶液中標(biāo)記率維持在97-88％，無(wú)明顯降低，說(shuō)明99Tcm-GX1具有良好的體內(nèi)外穩(wěn)定性。（2）受體放射自顯影術(shù)顯示99Tcm-GX1能夠與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，具有良好的生物學(xué)活性。
　　2.微觀放射自顯影、體外受體放射配基結(jié)合分析及競(jìng)爭(zhēng)

8、抑制分析、噬菌體體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示：（1）GX1短肽或噬菌體可特異性與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，與胃癌SGC7901細(xì)胞、結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞、永生化胃上皮細(xì)胞GES細(xì)胞未見(jiàn)明顯結(jié)合，說(shuō)明GX1與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合具有特異性。（2）GX1與共培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合量要高于單純培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞。Scatchard作圖顯示，GX1與共培養(yǎng)及單純培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的Kd值分別為3062pM、3831pM，每個(gè)細(xì)胞上的結(jié)合位點(diǎn)分別為1.17×104/Co-HU

9、VEC、0.88×104/HUVEC。
　　3.生物學(xué)分布結(jié)果顯示，標(biāo)記肽經(jīng)腎臟代謝，腫瘤組織的放射性高于肌肉、腸、甲狀腺和胃組織。在肝臟、脾臟、肺血供豐富的組織及血液，早期也有較高的放射性濃聚，隨時(shí)間延長(zhǎng)，放射性逐漸下降。腫瘤組織的分布0.5h為1.19±0.08％ID/g，24h降為0.74±0.02％ID/g，為肌肉組織的11倍。計(jì)算T/NT比值，從0.5到24h，腫瘤與肌肉、血液、肝、腎單位質(zhì)量的放射性比值呈遞增趨勢(shì)，提示

10、GX1具有腫瘤組織的靶向性特征。
　　4.將99Tcm-GX1尾靜脈注入荷瘤小鼠體內(nèi)，進(jìn)行ECT顯像，連續(xù)追蹤觀察24h，在裸鼠右后肢背側(cè)腫瘤部位可見(jiàn)一放射性濃聚灶，自8h開(kāi)始，逐漸高于心血池本底，18h顯影最清晰，至24h仍可見(jiàn)放射性濃聚影。對(duì)照組裸鼠尾靜脈注入99Tcm-OXT（催產(chǎn)素），進(jìn)行ECT顯像，在右后肢背側(cè)腫瘤部位也可見(jiàn)有放射性分布，但其放射性始終低于心血池本底。計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組裸鼠腫瘤部位和心臟部位的放射性比值，

11、實(shí)驗(yàn)組自8h開(kāi)始，比值呈上升趨勢(shì)，至24h，比值達(dá)1.4；對(duì)照組比值始終位于1以下。在荷結(jié)腸癌小鼠，也可見(jiàn)到腫瘤顯影。
　　【結(jié)論】
　　1.99Tcm直接法標(biāo)記GX1，標(biāo)記率大于90％，比活度高，體內(nèi)外穩(wěn)定性好，具有良好的生物學(xué)活性，完全可以滿(mǎn)足ECT顯像的要求。
　　2.GX1與內(nèi)皮細(xì)胞具有良好的受體結(jié)合特異性及親和力，其親和常數(shù)Kd值為3831pM，每個(gè)細(xì)胞上的結(jié)合位點(diǎn)為0.88×104/HUVEC。