人新基因TMEM98在炎癥中作用的體內外研究.pdf

1、隨著2006年人類基因組計劃(Human Genome Project，HGP)完成，誕生了大批新基因。迄今公認的人類編碼蛋白質的基因數(shù)量大約在20，000-25，000個，其中大部分基因功能尚不明確，這就為該領域的研究提供了廣泛的研究空間。擺在我們面前的關鍵問題之一就是如何將基因組序列信息轉化為基因功能信息，研究基因編碼的蛋白質在生理及病理狀態(tài)下的表達量的變化、與其它生物分子的相互作用關系以及作用機制、開展與免疫系統(tǒng)相關的分子機理研究

2、、發(fā)掘潛在的免疫相關分子，從而有助于深入認識疾病與基因的內在聯(lián)系以及疾病發(fā)生的分子機制，為基因相關疾病的治療尋找新的靶點。
　　2008年，國家人類基因組北方研究中心對人類基因組數(shù)據庫進行生物信息學分析，篩新的潛在細胞因子編碼基因，并進行功能篩選和系統(tǒng)研究，獲得若干候選基因，驗證多種蛋白，人跨膜蛋白98(transmembrane protein98，TMEM98)就是其中之一。迄今為止，對TMEM家族成員功能知之甚少，作用機制更

3、是鮮有報道。人TMEM98是沒有任何功能性文章報道的新基因，定位于17q11.2區(qū)段，有兩種可變剪切體，分別是TMEM98-v1和TMEM98-v2，v2的5'非編碼區(qū)與v1略有不同，但兩種突變體編碼產物相同。編碼一個由226個氨基酸組成的非經典分泌蛋白，分子量24.6 kDa，等電點4.718。各種屬之間同源性較高，與小鼠的蛋白的同源性達到98.7％。TMHMM分析預測其為Ⅰ型膜分子，但Signal P預測其N端的21個氨基酸是典型的

4、信號肽，與跨膜區(qū)（4-26氨基酸）重合，表明TMEM98可能為一種新的分泌蛋白，TMEM98在受到多種炎性因子刺激后表達上調，表明其可能與炎癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關。而腫瘤又與炎癥密切相關，多數(shù)腫瘤都伴有炎癥損傷，炎癥微環(huán)境又可促進腫瘤細胞的生存和發(fā)展。因此，TMEM98蛋白可能作為抗炎和抗腫瘤藥物研發(fā)的新靶點。
　　本實驗研究目的:
　　1.體外實驗:建立克雷伯桿菌（klebsiella pneumonia，Kp）肺炎動物模

5、型，給予TMEM98，觀察該蛋白對動物生存率、炎癥部位中性粒細胞浸潤、外周血及肺組織炎性因子產生情況的影響;
　　2.體內實驗:TMEM98刺激HUVEC、THP-1，分析對細胞因子、黏附分子、細胞增殖、凋亡以及相關通路的影響。
　　方法:
　　1.動物生存率及肺組織學檢測，建立正常對照組（氣管內注射PBS20μl）、給菌（氣管內注射109 cfu/ml Kp20μl）組及同時給菌（氣管內注射109 cfu/ml Kp

6、20μl）+TMEM98（注菌后1h尾靜脈注射TMEM98100 ng/只）組，觀察6h、12h、24h動物生存率;分離肺組織，用于HE染色;
　　2.建立肺炎模型，設正常對照組（氣管內注射PBS20μl）、給菌（氣管內注射108 cfu/ml Kp20μl）組及同時給菌（氣管內注射108 cfu/ml Kp20μl）+TMEM98（注菌后1h尾靜脈注射TMEM98100 ng/只）組，收集支氣管肺泡灌洗液，檢測其髓過氧化物酶活性

7、;分離血清，應用流式細胞術CBA法檢測血清中炎癥因子水平;分離肺組織，實時定量PCR檢測炎癥相關因子IL-1β、IL-6、KC、TNF-α、IFN以及通路蛋白NF-κB的表達情況;
　　3.炎性相關細胞株培養(yǎng)，MTT法檢測TMEM98對人臍靜脈內皮細胞HUVEC細胞增殖和凋亡的影響;收集HUVEC細胞，調整濃度為1×106個/ml，設立PBS絹(10μg/ml PBS)、TNF組(10μg/ml TNF-α)、TMEM98組(10

8、0 ng/ml)、TNF+TMEM98組（10μg/ml TNF-α+100 ng/ml TMEM98），各組給予相應處理后4h，實時定量PCR檢測TMEM98對HUVEC炎性細胞因子（CXCL-2、MCP-1、IL-6）mRNA表達的影響;收集THP-1細胞，調整濃度為1×106個/ml，建立PBS組(1μg/mlPBS)、LPS組(1μg/ml LPS)、TMEM98組(400 ng/ml)、LPS+TMEM98組(1μg/mlLP

9、S+400 ng/ml TMEM98)，作用后4h，實時定量PCR檢測TMEM98對THP-1炎性細胞因子(CXCL-2、IL-8) mRNA表達的影響;同樣劑量和分組處理HUVEC后48 h，Western blotting檢測TMEM98對HUVEC粘附分子VCAM-1、細胞內信號轉導分子MAPK8、轉錄因子NF-κB的蛋白水平影響。
　　結果:
　　1.體內實驗:
　　(1)生存率實驗提示TMEM98可抑制炎癥損

10、傷導致的死亡;
　　(2)支氣管肺泡灌洗液中髓過氧化物酶活性檢測表明TMEM98可抑制中性粒細胞的浸潤;
　　(3)炎癥因子檢測表明TMEM98在mRNA以及蛋白質水平均可抑制炎癥相關因子的產生;
　　2.體外實驗:
　　(1)體外細胞增殖和凋亡實驗:TMEM98對TNF-α誘導的HUVEC增殖有抑制作用，但對凋亡無明顯影響;
　　(2)實時定量PCR檢測炎性因子: TMEM98對TNF-α、LPS誘導HU

11、VEC、THP-1炎癥相關因子的產生(IL-6、IL-8、CXCL-2)有顯著抑制作用;
　　(3) Western blotting方法檢測炎癥相關通路蛋白:TMEM98能抑制TNF-α上調HUVEC細胞VCAM-1、NF-κB、MAPK8的表達。推測TMEM98對炎性細胞因子、蛋白的抑制作用可能與NF-κB、MAPK8兩條通路有關。
　　結論:
　　1.生物信息學分析TMEM98為分泌型蛋白且與炎癥有相關性;