人新基因TMEM98在炎癥中作用的體內(nèi)外研究.pdf

1、隨著2006年人類基因組計劃(Human Genome Project，HGP)完成，誕生了大批新基因。迄今公認(rèn)的人類編碼蛋白質(zhì)的基因數(shù)量大約在20，000-25，000個，其中大部分基因功能尚不明確，這就為該領(lǐng)域的研究提供了廣泛的研究空間。擺在我們面前的關(guān)鍵問題之一就是如何將基因組序列信息轉(zhuǎn)化為基因功能信息，研究基因編碼的蛋白質(zhì)在生理及病理狀態(tài)下的表達(dá)量的變化、與其它生物分子的相互作用關(guān)系以及作用機制、開展與免疫系統(tǒng)相關(guān)的分子機理研究

2、、發(fā)掘潛在的免疫相關(guān)分子，從而有助于深入認(rèn)識疾病與基因的內(nèi)在聯(lián)系以及疾病發(fā)生的分子機制，為基因相關(guān)疾病的治療尋找新的靶點。
　　2008年，國家人類基因組北方研究中心對人類基因組數(shù)據(jù)庫進行生物信息學(xué)分析，篩新的潛在細(xì)胞因子編碼基因，并進行功能篩選和系統(tǒng)研究，獲得若干候選基因，驗證多種蛋白，人跨膜蛋白98(transmembrane protein98，TMEM98)就是其中之一。迄今為止，對TMEM家族成員功能知之甚少，作用機制更

3、是鮮有報道。人TMEM98是沒有任何功能性文章報道的新基因，定位于17q11.2區(qū)段，有兩種可變剪切體，分別是TMEM98-v1和TMEM98-v2，v2的5'非編碼區(qū)與v1略有不同，但兩種突變體編碼產(chǎn)物相同。編碼一個由226個氨基酸組成的非經(jīng)典分泌蛋白，分子量24.6 kDa，等電點4.718。各種屬之間同源性較高，與小鼠的蛋白的同源性達(dá)到98.7％。TMHMM分析預(yù)測其為Ⅰ型膜分子，但Signal P預(yù)測其N端的21個氨基酸是典型的

4、信號肽，與跨膜區(qū)（4-26氨基酸）重合，表明TMEM98可能為一種新的分泌蛋白，TMEM98在受到多種炎性因子刺激后表達(dá)上調(diào)，表明其可能與炎癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。而腫瘤又與炎癥密切相關(guān)，多數(shù)腫瘤都伴有炎癥損傷，炎癥微環(huán)境又可促進腫瘤細(xì)胞的生存和發(fā)展。因此，TMEM98蛋白可能作為抗炎和抗腫瘤藥物研發(fā)的新靶點。
　　本實驗研究目的:
　　1.體外實驗:建立克雷伯桿菌（klebsiella pneumonia，Kp）肺炎動物模

5、型，給予TMEM98，觀察該蛋白對動物生存率、炎癥部位中性粒細(xì)胞浸潤、外周血及肺組織炎性因子產(chǎn)生情況的影響;
　　2.體內(nèi)實驗:TMEM98刺激HUVEC、THP-1，分析對細(xì)胞因子、黏附分子、細(xì)胞增殖、凋亡以及相關(guān)通路的影響。
　　方法:
　　1.動物生存率及肺組織學(xué)檢測，建立正常對照組（氣管內(nèi)注射PBS20μl）、給菌（氣管內(nèi)注射109 cfu/ml Kp20μl）組及同時給菌（氣管內(nèi)注射109 cfu/ml Kp

6、20μl）+TMEM98（注菌后1h尾靜脈注射TMEM98100 ng/只）組，觀察6h、12h、24h動物生存率;分離肺組織，用于HE染色;
　　2.建立肺炎模型，設(shè)正常對照組（氣管內(nèi)注射PBS20μl）、給菌（氣管內(nèi)注射108 cfu/ml Kp20μl）組及同時給菌（氣管內(nèi)注射108 cfu/ml Kp20μl）+TMEM98（注菌后1h尾靜脈注射TMEM98100 ng/只）組，收集支氣管肺泡灌洗液，檢測其髓過氧化物酶活性

7、;分離血清，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)CBA法檢測血清中炎癥因子水平;分離肺組織，實時定量PCR檢測炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-6、KC、TNF-α、IFN以及通路蛋白NF-κB的表達(dá)情況;
　　3.炎性相關(guān)細(xì)胞株培養(yǎng)，MTT法檢測TMEM98對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC細(xì)胞增殖和凋亡的影響;收集HUVEC細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×106個/ml，設(shè)立PBS絹(10μg/ml PBS)、TNF組(10μg/ml TNF-α)、TMEM98組(10

8、0 ng/ml)、TNF+TMEM98組（10μg/ml TNF-α+100 ng/ml TMEM98），各組給予相應(yīng)處理后4h，實時定量PCR檢測TMEM98對HUVEC炎性細(xì)胞因子（CXCL-2、MCP-1、IL-6）mRNA表達(dá)的影響;收集THP-1細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×106個/ml，建立PBS組(1μg/mlPBS)、LPS組(1μg/ml LPS)、TMEM98組(400 ng/ml)、LPS+TMEM98組(1μg/mlLP

9、S+400 ng/ml TMEM98)，作用后4h，實時定量PCR檢測TMEM98對THP-1炎性細(xì)胞因子(CXCL-2、IL-8) mRNA表達(dá)的影響;同樣劑量和分組處理HUVEC后48 h，Western blotting檢測TMEM98對HUVEC粘附分子VCAM-1、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子MAPK8、轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的蛋白水平影響。
　　結(jié)果:
　　1.體內(nèi)實驗:
　　(1)生存率實驗提示TMEM98可抑制炎癥損

10、傷導(dǎo)致的死亡;
　　(2)支氣管肺泡灌洗液中髓過氧化物酶活性檢測表明TMEM98可抑制中性粒細(xì)胞的浸潤;
　　(3)炎癥因子檢測表明TMEM98在mRNA以及蛋白質(zhì)水平均可抑制炎癥相關(guān)因子的產(chǎn)生;
　　2.體外實驗:
　　(1)體外細(xì)胞增殖和凋亡實驗:TMEM98對TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC增殖有抑制作用，但對凋亡無明顯影響;
　　(2)實時定量PCR檢測炎性因子: TMEM98對TNF-α、LPS誘導(dǎo)HU

11、VEC、THP-1炎癥相關(guān)因子的產(chǎn)生(IL-6、IL-8、CXCL-2)有顯著抑制作用;
　　(3) Western blotting方法檢測炎癥相關(guān)通路蛋白:TMEM98能抑制TNF-α上調(diào)HUVEC細(xì)胞VCAM-1、NF-κB、MAPK8的表達(dá)。推測TMEM98對炎性細(xì)胞因子、蛋白的抑制作用可能與NF-κB、MAPK8兩條通路有關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.生物信息學(xué)分析TMEM98為分泌型蛋白且與炎癥有相關(guān)性;