天麻提取物抗血小板聚集及抗乙酰膽堿酯酶活性的研究.pdf

1、本課題在前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)具有確切抗血小板聚集活性的天麻提取部位G2<'[1]>進(jìn)一步用硅膠柱色譜分離劃段，進(jìn)行活性追蹤；同時(shí)對(duì)天麻各提取部位進(jìn)行抗乙酰膽堿酯酶活性的研究。 目的：通過(guò)抗血小板聚集實(shí)驗(yàn)、血小板細(xì)胞鈣離子測(cè)定實(shí)驗(yàn)和乙酰膽堿酯酶實(shí)驗(yàn)，探討天麻治療老年癡呆的有效部位及作用機(jī)制。 方法：抗血小板聚集實(shí)驗(yàn) 采用Born氏比濁法，用二磷酸腺苷(ADP)和花生四烯酸(AA)誘導(dǎo)的家兔體外血小板聚集實(shí)驗(yàn)對(duì)分離段G<

2、,2A>、G<,2B>、G<,2C>和G<,2D>進(jìn)行活性篩選；用ADP、AA和PAF(血小板活化因子)誘導(dǎo)的兔體外血小板聚集實(shí)驗(yàn)對(duì)分離組分G<,2B1>、G<,2B2>、G<,2B3>、G<,2B4>和G<,2B5>進(jìn)行活性篩選：對(duì)不同濃度的分離組分G<,2B2>進(jìn)行抗ADP誘導(dǎo)的兔體外血小板聚集實(shí)驗(yàn)，觀察其作用強(qiáng)度和半數(shù)抑制濃度IC<,50>值；兔耳緣靜脈注射G<,2B2>進(jìn)行抗．ADP和AA誘導(dǎo)的血小板聚集實(shí)驗(yàn)，觀察其體內(nèi)顯效時(shí)間

3、、達(dá)峰時(shí)間、作用維持時(shí)間及最大抑制率；用ADP、AA和PAF誘導(dǎo)的兔體外血小板聚集實(shí)驗(yàn)，觀察1.0mg·mL<'-1>、0.1mg·mL<'-1>和0.01mg·mL<'-1>的天麻素對(duì)血小板聚集功能的影響。 血小板細(xì)胞鈣離子測(cè)定 采用雙波長(zhǎng)熒光光度法對(duì)分離組分G<,2B2>進(jìn)行抗血小板聚集作用機(jī)制即細(xì)胞內(nèi)鈣水平測(cè)定，觀察其對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板細(xì)胞內(nèi)總鈣、內(nèi)鈣釋放和外鈣內(nèi)流的影響：乙酰膽堿酯酶測(cè)定 采用改進(jìn)Ellman法觀察

4、天麻提取部位G1、G2、G3、G4和天麻素對(duì)乙酰膽堿酯酶活力的影響。 結(jié)果： 1．采用Bom氏比濁法，用ADP和AA誘導(dǎo)的家兔體外血小板聚集實(shí)驗(yàn)對(duì)分離段G<,2A>、G<,2B>、G<,2C>和G<,2D>進(jìn)行活性篩選：G<,2B>在終濃度2.2mg·mL<'-1>和1.1mg·mL,'-1>時(shí)，對(duì)ADP和AA誘導(dǎo)的血小板聚集均有明顯的抑制作用，高濃度(2.2 mg·mL<'-1>)所表現(xiàn)出的對(duì)聚集率的影響與低濃度(1.

5、1mg·mL<'-1>)相比，差異有非常顯著性意義(p<0.01)。 2．用ADP、AA和PAF誘導(dǎo)的兔體外血小板聚集實(shí)驗(yàn)對(duì)分離組分G<,2B1>、G<,2B2>、G<,2B3>、G<,2B4>和G<,2B5>進(jìn)行活性篩選：G<,2B2>作用較為明顯，在終濃度0.073mg·mL<'-1>時(shí)，對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的影響最為顯著，聚集率與對(duì)照組相比，差異有非常顯著性意義(p<0.01)：對(duì)AA誘導(dǎo)的血小板聚集亦有影響，為16.

6、31±3.89；對(duì)PAF誘導(dǎo)的血小板聚集無(wú)抑制作用。G<,2B1>在終濃度0.076mg·mL<'-1>時(shí)，對(duì)ADP、AA、PAF誘導(dǎo)的血小板聚集均有抑制作用，但抑制率不高，分別為25.39±5.29、23.18±3.87和20.88±5.57。 3．對(duì)不同濃度的分離組分G<,2B2>進(jìn)行抗ADP誘導(dǎo)的兔體外血小板聚集實(shí)驗(yàn)：G<,2B2>抗ADP誘導(dǎo)的兔體外血小板聚集作用明顯，且具有濃度依賴性，IC<,50>為61ug.mL<'

7、-1>，當(dāng)濃度在18ug.mL<'-1>時(shí)，與對(duì)照組比較差異有顯著性意義(p<0.05)。 4．兔耳緣靜脈注射G282進(jìn)行抗ADP和AA誘導(dǎo)的兔血小板聚集實(shí)驗(yàn)：G<,2B2>抗ADP誘導(dǎo)的血小板聚集作用最強(qiáng)，10min顯效，30min達(dá)峰，注射0.066g/Kg，作用維持120min；靜脈注射0.132g/Kg，作用維持180min，最大抑制率為87.44％。對(duì)AA誘導(dǎo)的兔血小板聚集的抑制作用相對(duì)較弱，10min顯效，30mi

8、n達(dá)峰，注射0.066g/Kg，作用維持60min；注射0.132 g/Kg，作用維持90min，最大抑制率為54.36％。 5．血小板細(xì)胞鈣離子測(cè)定實(shí)驗(yàn)：G<,2B2>能阻止ADP誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放和外鈣的內(nèi)流，在36ug.mL<'-1>。時(shí)，對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板細(xì)胞外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放與對(duì)照組相比差異均有非常顯著性意義(p<0.01)。在18ug·mL<'-1>時(shí)，僅對(duì)外鈣內(nèi)流有阻滯作用，對(duì)內(nèi)鈣釋放無(wú)影響。 6．乙酰

9、膽堿酯酶實(shí)驗(yàn)：G2在濃度為10.5 mg．mL<'-1>時(shí)的酶活力值與PBS組相比，差異具有非常顯著性意義(p<0.01)；G2在1.0mg·mL<'-1>時(shí)，與PBS組比較差異具有顯著性意義(p<0.05)；G3在1.7mg·mL<'-1>時(shí)，對(duì)酶活力的影響與PBS組比較差異也具有顯著性意義(p<0.05)；但中、低濃度的G4對(duì)乙酰膽堿酯酶活力影響，與PBS組比較差異均無(wú)顯著性意義(p>0.05)。 7．ADP、AA和PAF誘

10、導(dǎo)的兔體外血小板聚集實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明天麻素在1.Omg·mL<'-1>、O.1mg·mL<'-1>和O.0lmg·mL<'-1>下對(duì)血小板聚集均無(wú)抑制作用：乙酰膽堿酯酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：天麻素濃度僅在1.0mg·mL<'-1>時(shí)，對(duì)乙酰膽堿酯酶活力有影響，與PBS組比較，差異有顯著性意義(p<0.05)。 結(jié)論： 1．G<,2B2>體外、體內(nèi)均有明顯的抗血小板聚集作用，其體外對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集功能的抑制作用具有濃度依賴性

11、，IC<,50>為6lμg·mL<'-1>；體內(nèi)抗血小板聚集作用顯效快，維持時(shí)間隨著劑量加大而延長(zhǎng)。 2．G<,282>抗ADP誘導(dǎo)的血小板聚集作用機(jī)制之一是阻止血小板細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放和外鈣的內(nèi)流。 3．高、中、低濃度的G1、G2、G3和高濃度的G4對(duì)乙酰膽堿酯酶活力具有不同程度的抑制作用，G1、G2、G3對(duì)乙酰膽堿酯酶活力抑制作用明顯；中、低濃度的G4抑制作用不明顯。 4．所用劑量的天麻素對(duì)ADP、AA和PAF誘