IL-22對(duì)乙醛誘導(dǎo)的HSC-T6s增殖活化的影響及機(jī)制探討.pdf

1、目的：研究白介素-22(interleukin-22，IL-22)對(duì)乙醛誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSCs）增殖活化的影響，并探討抗氧化軸Nrf2-keap1-ARE在該作用中的地位。
　　方法：⑴HSC-T6s的培養(yǎng)：用含10％體積分?jǐn)?shù)胎牛血清、1%青-鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HSC-T6s，并置于37℃、5%CO2的孵箱中。⑵酒精性肝纖維化體外模型的建立：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠HSC-

2、T6s分為空白對(duì)照組和乙醛刺激組?？瞻讓?duì)照組：常規(guī)培養(yǎng)HSC-T6s；乙醛刺激組：在常規(guī)培養(yǎng)基中加入不同濃度（25、50、100、200、400μmol/L）的乙醛，并于干預(yù)后的24h和48h，四甲基偶氮唑藍(lán)法（3-(4,5-dimethylthiazol-2-thiazolyl)-2,5-di-phenly retrazolium bromid，MTT法）檢測(cè)各孔570nm處吸光度（Optical Density，OD）值，以此篩選出

3、最佳乙醛干預(yù)濃度及時(shí)間。⑶IL-22對(duì)乙醛誘導(dǎo)的HSC-T6s增殖活化的影響：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-T6s分為5組，空白對(duì)照組（常規(guī)培養(yǎng)48h）、乙醛模型組（常規(guī)培養(yǎng)基中加入200μmol/L乙醛作用48h）及低、中、高劑量IL-22干預(yù)組（含200μmol/L乙醛的培養(yǎng)基預(yù)處理24h后，再分別加用10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml IL-22共培養(yǎng)24h）。MTT法檢測(cè) HSC-T6s增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) HSC-T6s

4、細(xì)胞周期分布，western blotting及細(xì)胞免疫組化(immunocytochemistry，ICC)檢測(cè)α-平滑肌抗原（α-Smooth muscle antigen，α-SMA）蛋白的表達(dá)。⑷IL-22作用機(jī)制的探討：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-T6s如分組，western blotting及ICC法檢測(cè)核因子相關(guān)因子(nuclear factor erythroid-2 related factor，Nrf)2蛋白的表達(dá)及定位，分

5、光光度法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中丙二醛（malondialdehyde，MDA）和還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）的含量。采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-X±S）表示，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多組樣本均數(shù)的兩兩比較采用One-way ANOVA分析。
　　結(jié)果：①HSC-T6s細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，且性能穩(wěn)定。②與空白對(duì)照組相比，不同濃度乙醛刺激后HSC-T6s的OD值均升高（P<0.0

6、5），尤以200μmol/L作用48h最明顯，故選作后續(xù)造模條件。③流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示乙醛刺激HSC-T6s后G0/G1期細(xì)胞比例明顯降低，S期比例明顯升高，而加用IL-22干預(yù)后HSC-T6s則發(fā)生G1/S期阻滯，且呈現(xiàn)出劑量依賴性；western blotting和 ICC結(jié)果顯示模型組 HSC-T6s內(nèi)α-SMA表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05），而梯度濃度的 IL-22則可呈劑量依賴性的抑制α-SMA蛋白表達(dá)。④western blo

7、tting結(jié)果顯示各組Nrf2總蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異；但Nrf2核蛋白在空白對(duì)照組表達(dá)很少，模型組表達(dá)明顯增加，梯度濃度IL-22干預(yù)后可呈劑量依賴性進(jìn)一步促進(jìn)其表達(dá)（P<0.05）。ICC結(jié)果也顯示，與空白組相比，模型組Nrf2胞核陽(yáng)性率增加，加用IL-22干預(yù)后，隨著IL-22濃度增加，Nrf2胞核陽(yáng)性率也進(jìn)一步遞增，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。分光光度法結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組上清液中MDA及GSH含量均明顯升高（P<