1-磷酸鞘氨醇促進葡萄糖刺激的胰島素分泌及其可能機制研究.pdf

1、目的：研究1-磷酸鞘氨醇（Sphingosine-1-phosphate, S1P）促進葡萄糖刺激的胰島素分泌效應及其分子機制，探索糖尿病治療的藥物作用靶點。
　　方法：⑴斷頭處死大鼠，充分暴露胸腹腔，將膠原酶 P經(jīng)膽總管逆行注入胰腺，剝離后37℃水浴震蕩消化11分鐘，使用10771分離液梯度離心可獲得胰島。分離的胰島經(jīng)EDTA絡合鈣鎂離子后，Diapase II消化5分鐘，輕輕吹打后，可獲得大鼠胰島細胞（β細胞占多數(shù)）。⑵采用R

2、T-PCR方法，檢測大鼠胰島細胞表面S1PR1-5表達情況。⑶在不同葡萄糖濃度的條件下，觀察不同濃度 S1P對胰島β細胞分泌胰島素的變化；高糖條件下，觀察S1PR1-4阻斷劑及S1P+S1PR1-4阻斷劑對β細胞胰島素分泌的變化。⑷采用膜片鉗技術，觀察S1P、S1PR1-4阻斷劑及S1P+S1PR1-4阻斷劑對電壓依賴性鉀電流（Kv電流）的影響。⑸采用鈣成像技術，觀察不同濃度S1P對細胞內Ca2+水平的影響。⑹觀察S1P、S1PR1-4

3、阻斷劑、S1P+S1PR1-4阻斷劑及Forskolin對細胞內cAMP水平的影響。
　　結果：①經(jīng)膠原酶P消化獲得的大鼠胰島，質地均一，邊緣圓潤；經(jīng)Diapase II消化獲得的胰島細胞，大小均一，胞膜完整。②經(jīng)RT-PCR檢測，S1PR1-5在胰島細胞表面均為陽性表達。③與低糖對照組相比，高糖對照組顯著促進了胰島素分泌。在低糖條件下，不同濃度S1P沒有改變胰島素分泌量（P＞0.05）；而高糖條件下，S1P濃度依賴性促進了胰島素

4、的分泌（P＜0.001）。在高糖條件下，在單獨S1PR1-4阻斷劑并不影響胰島素分泌的基礎上，加入S1PR1-4阻斷劑消除了S1P對胰島素分泌的促進作用（P＜0.01）。④高糖條件下，S1P顯著抑制了Kv電流（P＜0.01）。在單獨S1PR1-4阻斷劑不影響Kv電流的基礎上，S1PR1-4阻斷劑消除了S1P對Kv電流的抑制作用（P＜0.01）。⑤高糖條件下，S1P濃度依賴性升高了細胞內Ca2+濃度（P＜0.001）。⑥Forskolin

5、作為陽性對照，S1P抑制了細胞內cAMP的生成（P＜0.01）。在單獨S1PR1-4阻斷劑不影響cAMP生成的基礎上，S1PR1-4阻斷劑消除了S1P對cAMP生成的抑制作用。
　　結論：⑴用膠原酶P消化獲得的胰島、用Diapase II消化獲得的胰島細胞邊緣圓潤、狀態(tài)良好。⑵胰島細胞表面表達有S1PR1-5。⑶S1P通過S1P/S1PRs濃度依賴性促進了葡萄糖刺激的胰島素分泌。⑷S1P通過S1P/S1PRs抑制了Kv電流。⑸S1