不同濃度的葡萄糖和胰島素對Colon26腫瘤細胞分泌免疫抑制物質的影響及其分子機制的研究.pdf

1、目的：腫瘤和糖尿病已成為當今嚴重危害人類健康和生命的重大疾病，它們的發(fā)病率和死亡率逐年升高。近年來，越來越多的臨床和流行病學資料顯示，糖尿病人易患結直腸癌。糖尿病患者與非糖尿病患者比較，患結直腸癌的風險明顯增加，已有人提出糖尿病是結直腸癌患病的獨立危險因素。糖尿病患者結直腸癌的發(fā)病率明顯高于非糖尿病患者，糖尿病人群中結直腸癌的復發(fā)率和死亡率亦明顯增加。糖尿病與結直腸癌的關系已經成為備受人們關注的熱點；研究和揭示兩者之間的病理生理關系及其

2、分子機制，已成為該領域中迫切需要進行探索的重要課題。
　　 腫瘤免疫學的研究已經揭示，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，不僅與機體的免疫功能密切相關，在某種意義上更與腫瘤細胞的免疫抑制作用密切相關。腫瘤細胞分泌免疫抑制物質抑制機體免疫功能，即腫瘤細胞的免疫抑制作用，是腫瘤細胞逃避機體免疫監(jiān)視，使腫瘤得以發(fā)生和發(fā)展的重要機制，在促進機體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有極其重要的作用。腫瘤細胞通過其分泌的免疫抑制物質，不但有可能在遠離腫瘤部位的機體其他部位發(fā)

3、揮免疫抑制作用，更可在腫瘤局部形成深度免疫抑制區(qū)，即所謂“黑洞”區(qū)，以至于不僅使原本就在此區(qū)之中的原位免疫細胞功能嚴重受抑，而且還能使由此區(qū)之外進入其中的功能正常甚至已經活化的免疫細胞成為功能受抑的“沉默”細胞，從而使之失去有效清除腫瘤細胞的能力，顯然這是在即使免疫功能完全正常的機體中腫瘤也能逃避機體免疫監(jiān)視而得以發(fā)生和發(fā)展的重要機制。
　　 糖尿病重要的病理生理特征之一，就是患者血中葡萄糖和胰島素水平的異常改變。現(xiàn)代醫(yī)學也正是

4、依據患者血中葡萄糖和胰島素水平的異常改變，將糖尿病的自然病程分為四個階段。糖尿病自然病程不同階段血中的葡萄糖和胰島素，各有與其所處病程階段相應的不同濃度。糖尿病患者易患結直腸癌，是否與其自然病程不同階段血中不同濃度的葡萄糖和胰島素能影響結直腸癌腫瘤細胞分泌免疫抑制物質有關，目前國內外尚未見報道，十分需要對之進行研究和探討。迄今，已見于報道能由腫瘤細胞分泌的免疫抑制物質多達20余種。其中，轉化生長因子-β1（TGF-β1）、血管內皮生長因

5、子（VEGF）和白細胞介素-6（IL-6），是見諸報道較多、免疫抑制作用較強，并且也恰是可由結直腸癌腫瘤細胞株Colon26腫瘤細胞分泌的三種重要的免疫抑制物質。因此，本研究選用小鼠結直腸癌腫瘤細胞株Colon26腫瘤細胞作為研究對象，以模擬糖尿病自然病程血中不同濃度的葡萄糖和胰島素對之進行作用，測定是否對Colon26腫瘤細胞分泌這三種免疫抑制物質有影響和有何影響，并初步探索是通過何種分子機制導致了這種影響。從影響結直腸癌腫瘤細胞分泌

6、免疫抑制物質的角度，為研究糖尿病與結直腸癌之間的病理生理關系，揭示糖尿病患者為何易患結直腸癌，提供新的研究思路和實驗依據。
　　 方法：體外常規(guī)培養(yǎng)Colon26腫瘤細胞。根據培養(yǎng)液（RPMI1640完全培養(yǎng)基，CM）中外加葡萄糖和胰島素的終濃度不同，分為12個組：A組（對照組，Control），CM；B組（常糖組，nG），5mmol/L葡萄糖；C組（中糖組，mG），10mmol/L葡萄糖；D組（高糖組，hG），25mmol/L

7、葡萄糖；E組（常胰島素組，nI），5μIU/mL胰島素；F組（中胰島素組，mI），25μIU/mL胰島素；G組（高胰島素組，hI），125μIU/mL胰島素；H組（常糖常胰島素組，nGnI），5mmol/L葡萄糖和5μIU/mL胰島素；K組（常糖高胰島素組，nGhI），5mmol/L葡萄糖和125μIU/mL胰島素；L組（高糖高胰島素組，hGhI），25mmol/L葡萄糖和125μIU/mL胰島素；M組（高糖常胰島素組，hGnI），25

8、mmol/L葡萄糖和5μIU/mL胰島素；N組（高糖低胰島素組，hGloI），25mmol/L葡萄糖和1.25μIU/mL胰島素。每組均設3個復孔，置37℃5％CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結束后，分別收集細胞培養(yǎng)上清和細胞。ELISA法分別檢測細胞培養(yǎng)上清中VEGF、TGF-β1和IL-6的含量（pg/mL）。將所收集細胞抽提總RNA，采用RT-PCR法擴增目的片段VEGF、TGF-β1、IL-6和內參照β-actin，擴增

9、產物行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上掃描分析，分別計算VEGF、TGF-β1和IL-6 mRNA相對表達量，表達強度以相對表達系數RC表示。全部實驗重復三次，結果數據以三次重復實驗的x±s表示。統(tǒng)計學分析采用t檢驗和單因素方差分析，以P<0.05為有統(tǒng)計學差異。
　　 結論：
　　 1.高濃度（25mmol/L）的葡萄糖可顯著增加Colon26腫瘤細胞分泌TGF-β1和IL-6，其分子機制應是由促進Colon26腫瘤細

10、胞TGF-β1和IL-6基因轉錄所致。
　　 2.不同濃度[（5-25）mmol/L]的葡萄糖對Colon26腫瘤細胞VEGF的分泌和基因轉錄無影響。
　　 3.高濃度（125μIU/mL）的胰島素可顯著增加Colon26腫瘤細胞分泌VEGF，其分子機制應是由促進Colon26腫瘤細胞VEGF基因轉錄所致。
　　 4.不同濃度[（1.25-125）μIU/mU的胰島素對Colon26腫瘤細胞TGF-β1和IL-6

11、的分泌及基因轉錄無影響。
　　 5.不同濃度的葡萄糖和胰島素聯(lián)合，不改變各自單獨對Colon26腫瘤細胞VEGF、TGF-β1和IL-6的分泌及基因轉錄的作用模式。
　　 6.不同濃度的葡萄糖和胰島素聯(lián)合，對Colon26腫瘤細胞VEGF、TGF-β1和IL-6的分泌及基因轉錄，既無協(xié)同效應也無牯抗效應。
　　 7.糖尿病自然病程中不同濃度的葡萄糖和胰島素可顯著增加結直腸癌腫瘤細胞某些免疫抑制物質分泌，應是糖尿病