FoxO1對胰島素抵抗細胞葡萄糖消耗的影響及機制研究.pdf

1、背景與目的：胰島素抵抗(insulin resistance,IR)是2型糖尿病(Diabetes mellitus,DM)發(fā)病機制中的一個重要因素,并且是肥胖,血脂異常,高血壓,冠心病等代謝綜合征的一個重要特征。因此IR一直是人們研究的熱點。近年來,IR的發(fā)病機制,尤其是胰島素信號轉導異常在IR發(fā)生中的作用受到極大關注。叉頭狀轉錄因子O1(forkhead transcription factor O1,FoxO1)屬于Fox轉錄因子

2、O亞家族,是細胞內能量代謝的重要調節(jié)因子,同時也是胰島素/胰島素樣生長因子-1(insulin/insulin-like growth factor1,INS/IGF-1)信號通路中的關鍵分子。研究發(fā)現(xiàn):FoxO1表達升高可上調糖異生途徑關鍵酶的表達,影響肝臟葡萄糖輸出;抑制糖尿病小鼠Foxo1基因表達后,發(fā)現(xiàn)其血糖水平顯著下降,且肝臟組織糖異生途徑關鍵酶的表達水平降低。以上研究表明FoxO1表達異常與IR有重要關系。但目前關于FoxO

3、1與IR關系的研究尚少,抑制FoxO1表達能否改善IR及其詳細機制尚不明確。胰島素受體底物-2(insulin receptor substrate-2,IRS-2)是肝臟內的主要胰島素受體底物(insulin receptor substrate,IRS)亞型,在胰島素促進肝糖原合成,抑制糖異生和肝糖輸出的信號轉導中,IRS-2是重要信號分子,其表達異?？芍赂闻KIR。最近研究表明:通過轉基因技術在大鼠肝臟增強FoxO1表達,饑餓狀態(tài)時

4、,表達增強FoxO1可通過反饋機制促進的IRS-2基因表達。然而,胰島素抵抗狀態(tài)時,抑制FoxO1基因表達對IRS-2表達的影響尚不清楚,關于兩者關系的研究尚未見報道。本研究通過高濃度胰島素誘導構建IR細胞模型,運用RNA干擾(RNAinterference,RNAi)技術抑制IR細胞中FoxO1基因表達,在此基礎上使用葡萄糖氧化酶法檢測糖的利用,采用免疫沉淀和western bolt技術檢測IRS-2蛋白表達及酪氨酸磷酸化水平;旨在探

5、討抑制FoxO1基因表達對IR細胞葡萄糖利用的影響及可能機制,為研究FoxO1在IR發(fā)生發(fā)展過程中的作用打下基礎,同時為IR的治療提供一定的理論依據(jù)。
　　材料與方法：1.采用高濃度胰島素(10-6mol.L-1)誘導HepG-2細胞24h,建立IR細胞模型,并研究IR細胞模型持續(xù)時間。2.FoxO1特異性小干擾RNA(small interference RNA,siRNA)載體的構建及測序鑒定。3.實驗分組及處理。實驗共分4組

6、,A組:普通培養(yǎng)基孵育的HepG-2細胞組;B組:高胰島素誘導建立的IR細胞組;C組:轉染FoxO1 siRNA載體的IR細胞組;D組:轉染試劑Lipofectamine2000為對照的IR細胞組。當細胞處于90％融合時進行轉染,操作按照Lipofectamine2000說明書進行。4.熒光顯微鏡下觀察轉染情況。FoxO1 siRNA載體攜帶紅色熒光標記,在轉染后24h、48h、72h,分別于熒光顯微鏡下觀查細胞內紅色熒光的表達量,間接

7、評估質粒載體轉染入細胞的情況。5.轉染后24h,計數(shù)細胞,調整細胞密度,各實驗組均傳代一次,在含有10-9mol.L-1胰島素的培養(yǎng)液中孵育24h后,采用葡萄糖氧化酶法檢測各組培養(yǎng)基中葡萄糖含量,以不鋪細胞的空白孔為對照,計算24h葡萄糖消耗量。6.轉染后48h,分別收集各組細胞,采用RT-PCR技術檢測FoxO1mRNA的表達;采用Western blot,免疫沉淀技術檢測IRS-2蛋白表達和IRS-2蛋白酪氨酸磷酸化水平。實驗所得計

8、量數(shù)值用平均數(shù)±標準差((?)±s)表示。采用統(tǒng)計軟件SPSS12.0行統(tǒng)計學分析,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　結果：1.胰島素抵抗HepG-2細胞模型的建立及持續(xù)時間HepG-2細胞加人新配制的含有10-6mol.L-1胰島素的培養(yǎng)液,并設無胰島素的空白組,于37℃,5％CO2培養(yǎng)箱中孵育24h,隨后胃于含10-9mol.L-1胰島素的培養(yǎng)基中24h,采用葡萄糖氧化酶法

9、檢測培養(yǎng)基中的葡萄糖含量,以不鈉細胞的空白孔為對照。結果表明胰島素組與空白組比較,葡萄糖消耗量減少約47.58％(1.76±0.07 vs3.37±0.08),胰島素組細胞表現(xiàn)出明顯的胰島素抵抗。造模成功后,將模型組和空白組分別置于不含腆島素的培養(yǎng)基中24、48、72h,重復上述方法計算葡萄糖消耗量,結果表明模型組細胞葡萄糖消耗量在48h內明顯低于空白組(P<0.01),提示高濃度胰島素誘導建立的胰島素抵抗HepG-2細胞模型其IR特性

10、在48h內較為穩(wěn)定。2.重組質粒載體的測序將重組質粒載體用LB培養(yǎng)基擴大培養(yǎng),提取質粒送往TaKaRa公司測序,測序結果顯示同設計序列完全相同,載體構建成功。3.熒光顯微鏡下觀察轉染情況采用Lipofectamine2000為轉染試劑,IR細胞轉染攜帶紅色熒光的FoxO1siRNA載體(pSIREN-DNR-DsRed-siFoxO1),24h后倒置熒光顯微鏡下觀察細胞內可見紅色熒光表達,48h后熒光表達明顯增強,72h時熒光表達減弱,

11、認為轉染后48h FoxO1 siRNA載體在細胞內成功且大量表達。4.葡萄糖氧化酶法檢測各實驗組細胞葡萄糖消耗IR細胞組與普通細胞組相比,葡萄糖消耗明顯減少(1.90±0.07 vs2.81±0.08,P<0.01);轉染FoxO1特異性siRNA載體的IR組與未轉染IR組比較,葡萄糖消耗增加(2.03±0.14 vs1.90±0.07,P<0.05);Lipofectamine2000處理組與IR組相比,葡萄糖消耗差異不具有統(tǒng)計學意

12、義(1.84±0.10 vs1.90±0.07,P>0.05)。5.RT-PCR技術檢測各實驗組FoxO1 mRNA的表達與普通細胞組相比,IR細胞組FoxO1 mRNA的表達增強(0.34±0.01vs0.31±0.01,P<0.05);IR細胞組在轉染FoxO1特異性siRNA載體后,FoxO1 mRNA的表達水平明顯下降(0.24±0.03vs0.34±0.01,P<0.01);Lipofectamine2000處理組FoxO1

13、mRNA的表達與IR組相比,差異不具有統(tǒng)計學意義(0.33±0.03 vs0.34±0.01,P>0.05)。6.IRS-2蛋白表達及其酪氨酸磷酸化水平的檢測Western blot分析結果顯示IRS-2蛋白表達各組之間無顯著性差異(F=1.20,P>0.05)。免疫沉淀結果顯示:與普通細胞組相比,IR細胞組IRS-2酪氨酸磷酸化減低(Western blot灰度值(×103)為5.64±0.21 vs6.92±0.14,P<0.01)

14、;轉染FoxO1特異性siRNA載體后的IR細胞組與未轉染IR組比較,IRS-2酪氨酸磷酸化增強(Western blot灰度值(×103)為6.66±0.17 vs5.64±0.21,P<0.01);Lipofectamine2000處理組IRS-2酪氨酸磷酸化水平與IR組相比,差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　結論：1.高濃度胰島素誘導建立的胰島素抵抗HepG-2細胞中,FoxO1 mRNA的表達增強,IRS-2酪氨