FoxO1對(duì)胰島素抵抗細(xì)胞葡萄糖消耗的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：胰島素抵抗(insulin resistance,IR)是2型糖尿病(Diabetes mellitus,DM)發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)重要因素,并且是肥胖,血脂異常,高血壓,冠心病等代謝綜合征的一個(gè)重要特征。因此IR一直是人們研究的熱點(diǎn)。近年來(lái),IR的發(fā)病機(jī)制,尤其是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常在IR發(fā)生中的作用受到極大關(guān)注。叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1(forkhead transcription factor O1,FoxO1)屬于Fox轉(zhuǎn)錄因子

2、O亞家族,是細(xì)胞內(nèi)能量代謝的重要調(diào)節(jié)因子,同時(shí)也是胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin/insulin-like growth factor1,INS/IGF-1)信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子。研究發(fā)現(xiàn):FoxO1表達(dá)升高可上調(diào)糖異生途徑關(guān)鍵酶的表達(dá),影響肝臟葡萄糖輸出;抑制糖尿病小鼠Foxo1基因表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)其血糖水平顯著下降,且肝臟組織糖異生途徑關(guān)鍵酶的表達(dá)水平降低。以上研究表明FoxO1表達(dá)異常與IR有重要關(guān)系。但目前關(guān)于FoxO

3、1與IR關(guān)系的研究尚少,抑制FoxO1表達(dá)能否改善IR及其詳細(xì)機(jī)制尚不明確。胰島素受體底物-2(insulin receptor substrate-2,IRS-2)是肝臟內(nèi)的主要胰島素受體底物(insulin receptor substrate,IRS)亞型,在胰島素促進(jìn)肝糖原合成,抑制糖異生和肝糖輸出的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中,IRS-2是重要信號(hào)分子,其表達(dá)異?？芍赂闻KIR。最近研究表明:通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)在大鼠肝臟增強(qiáng)FoxO1表達(dá),饑餓狀態(tài)時(shí)

4、,表達(dá)增強(qiáng)FoxO1可通過(guò)反饋機(jī)制促進(jìn)的IRS-2基因表達(dá)。然而,胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)時(shí),抑制FoxO1基因表達(dá)對(duì)IRS-2表達(dá)的影響尚不清楚,關(guān)于兩者關(guān)系的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)高濃度胰島素誘導(dǎo)構(gòu)建IR細(xì)胞模型,運(yùn)用RNA干擾(RNAinterference,RNAi)技術(shù)抑制IR細(xì)胞中FoxO1基因表達(dá),在此基礎(chǔ)上使用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)糖的利用,采用免疫沉淀和western bolt技術(shù)檢測(cè)IRS-2蛋白表達(dá)及酪氨酸磷酸化水平;旨在探

5、討抑制FoxO1基因表達(dá)對(duì)IR細(xì)胞葡萄糖利用的影響及可能機(jī)制,為研究FoxO1在IR發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用打下基礎(chǔ),同時(shí)為IR的治療提供一定的理論依據(jù)。
　　材料與方法：1.采用高濃度胰島素(10-6mol.L-1)誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞24h,建立IR細(xì)胞模型,并研究IR細(xì)胞模型持續(xù)時(shí)間。2.FoxO1特異性小干擾RNA(small interference RNA,siRNA)載體的構(gòu)建及測(cè)序鑒定。3.實(shí)驗(yàn)分組及處理。實(shí)驗(yàn)共分4組

6、,A組:普通培養(yǎng)基孵育的HepG-2細(xì)胞組;B組:高胰島素誘導(dǎo)建立的IR細(xì)胞組;C組:轉(zhuǎn)染FoxO1 siRNA載體的IR細(xì)胞組;D組:轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000為對(duì)照的IR細(xì)胞組。當(dāng)細(xì)胞處于90％融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,操作按照Lipofectamine2000說(shuō)明書進(jìn)行。4.熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。FoxO1 siRNA載體攜帶紅色熒光標(biāo)記,在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h,分別于熒光顯微鏡下觀查細(xì)胞內(nèi)紅色熒光的表達(dá)量,間接

7、評(píng)估質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞的情況。5.轉(zhuǎn)染后24h,計(jì)數(shù)細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度,各實(shí)驗(yàn)組均傳代一次,在含有10-9mol.L-1胰島素的培養(yǎng)液中孵育24h后,采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)各組培養(yǎng)基中葡萄糖含量,以不鋪細(xì)胞的空白孔為對(duì)照,計(jì)算24h葡萄糖消耗量。6.轉(zhuǎn)染后48h,分別收集各組細(xì)胞,采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)FoxO1mRNA的表達(dá);采用Western blot,免疫沉淀技術(shù)檢測(cè)IRS-2蛋白表達(dá)和IRS-2蛋白酪氨酸磷酸化水平。實(shí)驗(yàn)所得計(jì)

8、量數(shù)值用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示。采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS12.0行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：1.胰島素抵抗HepG-2細(xì)胞模型的建立及持續(xù)時(shí)間HepG-2細(xì)胞加人新配制的含有10-6mol.L-1胰島素的培養(yǎng)液,并設(shè)無(wú)胰島素的空白組,于37℃,5％CO2培養(yǎng)箱中孵育24h,隨后胃于含10-9mol.L-1胰島素的培養(yǎng)基中24h,采用葡萄糖氧化酶法

9、檢測(cè)培養(yǎng)基中的葡萄糖含量,以不鈉細(xì)胞的空白孔為對(duì)照。結(jié)果表明胰島素組與空白組比較,葡萄糖消耗量減少約47.58％(1.76±0.07 vs3.37±0.08),胰島素組細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的胰島素抵抗。造模成功后,將模型組和空白組分別置于不含腆島素的培養(yǎng)基中24、48、72h,重復(fù)上述方法計(jì)算葡萄糖消耗量,結(jié)果表明模型組細(xì)胞葡萄糖消耗量在48h內(nèi)明顯低于空白組(P<0.01),提示高濃度胰島素誘導(dǎo)建立的胰島素抵抗HepG-2細(xì)胞模型其IR特性

10、在48h內(nèi)較為穩(wěn)定。2.重組質(zhì)粒載體的測(cè)序?qū)⒅亟M質(zhì)粒載體用LB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng),提取質(zhì)粒送往TaKaRa公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果顯示同設(shè)計(jì)序列完全相同,載體構(gòu)建成功。3.熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況采用Lipofectamine2000為轉(zhuǎn)染試劑,IR細(xì)胞轉(zhuǎn)染攜帶紅色熒光的FoxO1siRNA載體(pSIREN-DNR-DsRed-siFoxO1),24h后倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)紅色熒光表達(dá),48h后熒光表達(dá)明顯增強(qiáng),72h時(shí)熒光表達(dá)減弱,

11、認(rèn)為轉(zhuǎn)染后48h FoxO1 siRNA載體在細(xì)胞內(nèi)成功且大量表達(dá)。4.葡萄糖氧化酶法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞葡萄糖消耗IR細(xì)胞組與普通細(xì)胞組相比,葡萄糖消耗明顯減少(1.90±0.07 vs2.81±0.08,P<0.01);轉(zhuǎn)染FoxO1特異性siRNA載體的IR組與未轉(zhuǎn)染IR組比較,葡萄糖消耗增加(2.03±0.14 vs1.90±0.07,P<0.05);Lipofectamine2000處理組與IR組相比,葡萄糖消耗差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

12、義(1.84±0.10 vs1.90±0.07,P>0.05)。5.RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組FoxO1 mRNA的表達(dá)與普通細(xì)胞組相比,IR細(xì)胞組FoxO1 mRNA的表達(dá)增強(qiáng)(0.34±0.01vs0.31±0.01,P<0.05);IR細(xì)胞組在轉(zhuǎn)染FoxO1特異性siRNA載體后,FoxO1 mRNA的表達(dá)水平明顯下降(0.24±0.03vs0.34±0.01,P<0.01);Lipofectamine2000處理組FoxO1

13、mRNA的表達(dá)與IR組相比,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.33±0.03 vs0.34±0.01,P>0.05)。6.IRS-2蛋白表達(dá)及其酪氨酸磷酸化水平的檢測(cè)Western blot分析結(jié)果顯示IRS-2蛋白表達(dá)各組之間無(wú)顯著性差異(F=1.20,P>0.05)。免疫沉淀結(jié)果顯示:與普通細(xì)胞組相比,IR細(xì)胞組IRS-2酪氨酸磷酸化減低(Western blot灰度值(×103)為5.64±0.21 vs6.92±0.14,P<0.01)

14、;轉(zhuǎn)染FoxO1特異性siRNA載體后的IR細(xì)胞組與未轉(zhuǎn)染IR組比較,IRS-2酪氨酸磷酸化增強(qiáng)(Western blot灰度值(×103)為6.66±0.17 vs5.64±0.21,P<0.01);Lipofectamine2000處理組IRS-2酪氨酸磷酸化水平與IR組相比,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論：1.高濃度胰島素誘導(dǎo)建立的胰島素抵抗HepG-2細(xì)胞中,FoxO1 mRNA的表達(dá)增強(qiáng),IRS-2酪氨