spata3基因參與小鼠生殖細胞發(fā)育及其初步功能研究.pdf

1、目的：
　　明確spata3基因mRNA及其編碼蛋白產(chǎn)物在小鼠睪丸組織中的特異表達特性；運用分子克隆技術(shù)構(gòu)建spata3的真核表達質(zhì)粒并建立spata3過表達HEK293T細胞模型；分析spata3過表達HEK293T細胞中細胞凋亡和細胞自噬相關(guān)蛋白的表達；進一步構(gòu)建spata3過表達慢病毒載體并建立穩(wěn)定表達GC2-spd細胞模型；分析spata3穩(wěn)定表達GC2-spd細胞中細胞自噬相關(guān)蛋白的表達；為進一步探究在精子發(fā)生過程中sp

2、ata3所發(fā)揮的的作用及意義奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.采用RT-PCR分析spata3基因mRNA在小鼠各組織中的表達；
　　2.利用Western blotting分析SPATA3蛋白在小鼠各組織中的表達；
　　3.應(yīng)用免疫組織化學染色檢測SPATA3蛋白在小鼠睪丸組織中的細胞定位；
　　4.通過間接免疫熒光染色觀察SPATA3蛋白在小鼠生精細胞中的定位分布；
　　5.利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建sp

3、ata3真核表達重組質(zhì)粒pLV-EGFP(2A)Puro-spata3；
　　6.采用RT-PCR和Western blotting分析重組質(zhì)粒pLV-EGFP(2A)Puro-spata3轉(zhuǎn)染HEK293T細胞后spata3 mRNA和蛋白的表達水平；
　　7.采用間接免疫熒光染色檢測SPATA3蛋白在過表達HEK293T細胞中的定位分布；
　　8.采用Western blotting檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白Caspas

4、e3、PARP、Bax和Bcl-2以及細胞自噬相關(guān)蛋白Lc3A/B的表達水平；
　　9.過表達慢病毒載體瞬時感染HEK293T細胞；采用RT-PCR和Western blotting檢測spata3在HEK293T細胞中的瞬時表達；
　　10.建立穩(wěn)定表達spata3的GC2-spd細胞模型；采用RT-PCR和Western blotting檢測spata3在GC2-spd細胞中的穩(wěn)定表達；
　　11.采用Wester

5、n blotting檢測自噬相關(guān)蛋白Lc3A/B在spata3穩(wěn)定表達GC2-spd細胞中的表達水平。
　　12.采用間接免疫熒光染色檢測自噬相關(guān)蛋白Lc3A/B在spata3穩(wěn)定表達GC2-spd細胞中的分布。
　　結(jié)果：
　　1. RT-PCR結(jié)果顯示spata3基因mRNA在小鼠睪丸組織特異表達；
　　2. Western blotting結(jié)果顯示SPATA3蛋白在小鼠睪丸組織特異表達；
　　3.免疫

6、組織化學染色結(jié)果表明SPATA3蛋白主要定位在曲精小管內(nèi)圓形精子細胞、粗線期精母細胞和長形精子細胞中，間質(zhì)細胞、支持細胞、精原細胞、前細線期精母細胞中未見SPATA3明顯陽性信號；
　　4.免疫熒光分析顯示粗線期精母細胞和圓形精子細胞的胞漿與胞核均有顯著SPATA3蛋白的陽性著色，長形精子細胞的胞漿也有大量分布；
　　5. DNA測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒pLV-EGFP(2A)Puro-spata3構(gòu)建成功；
　　6.重組

7、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細胞后，經(jīng)RT-PCR和Western blotting檢測表明spata3基因在HEK293T內(nèi)過表達；
　　7.細胞免疫熒光染色分析顯示在HEK293T細胞內(nèi)過表達的SPATA3蛋白分布廣泛，但核周熒光信號明顯強于胞核；
　　8. Western blotting結(jié)果表明過表達spata3的293T細胞中細胞凋亡相關(guān)蛋白及自噬相關(guān)蛋白Caspase3、PARP無明顯變化，Bax、Lc3A/B蛋白水平

8、高于對照組（P<0.01），而Bcl-2蛋白含量低于對照組（P<0.01），差異具有統(tǒng)計學意義；
　　9. RT-PCR和Western blotting結(jié)果表明spata3慢病毒載體在HEK293T細胞中過表達，表明慢病毒載體構(gòu)建成功；
　　10. RT-PCR和Western blotting結(jié)果表明spata3慢病毒載體在GC2-spd細胞中過表達，spata3過表達GC2-spd穩(wěn)定細胞模型構(gòu)建成功；
　　11

9、. Western blotting結(jié)果表明過表達spata3的GC2-spd穩(wěn)定細胞中自噬相關(guān)蛋白Lc3A/B蛋白含量高于對照組（P<0.01），差異具有統(tǒng)計學意義。
　　12.細胞免疫熒光染色分析顯示過表達spata3的GC2-spd穩(wěn)定細胞中自噬相關(guān)蛋白Lc3A/B熒光信號在核周呈點狀廣泛分布；
　　結(jié)論：
　　1. spata3基因在小鼠睪丸組織大量表達，并具有生精細胞定位特異性。
　　2.成功建立了sp