spata3基因參與小鼠生殖細(xì)胞發(fā)育及其初步功能研究.pdf

1、目的：
　　明確spata3基因mRNA及其編碼蛋白產(chǎn)物在小鼠睪丸組織中的特異表達(dá)特性；運(yùn)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建spata3的真核表達(dá)質(zhì)粒并建立spata3過(guò)表達(dá)HEK293T細(xì)胞模型；分析spata3過(guò)表達(dá)HEK293T細(xì)胞中細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)；進(jìn)一步構(gòu)建spata3過(guò)表達(dá)慢病毒載體并建立穩(wěn)定表達(dá)GC2-spd細(xì)胞模型；分析spata3穩(wěn)定表達(dá)GC2-spd細(xì)胞中細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)；為進(jìn)一步探究在精子發(fā)生過(guò)程中sp

2、ata3所發(fā)揮的的作用及意義奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.采用RT-PCR分析spata3基因mRNA在小鼠各組織中的表達(dá)；
　　2.利用Western blotting分析SPATA3蛋白在小鼠各組織中的表達(dá)；
　　3.應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)SPATA3蛋白在小鼠睪丸組織中的細(xì)胞定位；
　　4.通過(guò)間接免疫熒光染色觀察SPATA3蛋白在小鼠生精細(xì)胞中的定位分布；
　　5.利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建sp

3、ata3真核表達(dá)重組質(zhì)粒pLV-EGFP(2A)Puro-spata3；
　　6.采用RT-PCR和Western blotting分析重組質(zhì)粒pLV-EGFP(2A)Puro-spata3轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后spata3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平；
　　7.采用間接免疫熒光染色檢測(cè)SPATA3蛋白在過(guò)表達(dá)HEK293T細(xì)胞中的定位分布；
　　8.采用Western blotting檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspas

4、e3、PARP、Bax和Bcl-2以及細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Lc3A/B的表達(dá)水平；
　　9.過(guò)表達(dá)慢病毒載體瞬時(shí)感染HEK293T細(xì)胞；采用RT-PCR和Western blotting檢測(cè)spata3在HEK293T細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)；
　　10.建立穩(wěn)定表達(dá)spata3的GC2-spd細(xì)胞模型；采用RT-PCR和Western blotting檢測(cè)spata3在GC2-spd細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)；
　　11.采用Wester

5、n blotting檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Lc3A/B在spata3穩(wěn)定表達(dá)GC2-spd細(xì)胞中的表達(dá)水平。
　　12.采用間接免疫熒光染色檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Lc3A/B在spata3穩(wěn)定表達(dá)GC2-spd細(xì)胞中的分布。
　　結(jié)果：
　　1. RT-PCR結(jié)果顯示spata3基因mRNA在小鼠睪丸組織特異表達(dá)；
　　2. Western blotting結(jié)果顯示SPATA3蛋白在小鼠睪丸組織特異表達(dá)；
　　3.免疫

6、組織化學(xué)染色結(jié)果表明SPATA3蛋白主要定位在曲精小管內(nèi)圓形精子細(xì)胞、粗線期精母細(xì)胞和長(zhǎng)形精子細(xì)胞中，間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞、精原細(xì)胞、前細(xì)線期精母細(xì)胞中未見(jiàn)SPATA3明顯陽(yáng)性信號(hào)；
　　4.免疫熒光分析顯示粗線期精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞的胞漿與胞核均有顯著SPATA3蛋白的陽(yáng)性著色，長(zhǎng)形精子細(xì)胞的胞漿也有大量分布；
　　5. DNA測(cè)序結(jié)果表明重組質(zhì)粒pLV-EGFP(2A)Puro-spata3構(gòu)建成功；
　　6.重組

7、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后，經(jīng)RT-PCR和Western blotting檢測(cè)表明spata3基因在HEK293T內(nèi)過(guò)表達(dá)；
　　7.細(xì)胞免疫熒光染色分析顯示在HEK293T細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)的SPATA3蛋白分布廣泛，但核周熒光信號(hào)明顯強(qiáng)于胞核；
　　8. Western blotting結(jié)果表明過(guò)表達(dá)spata3的293T細(xì)胞中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及自噬相關(guān)蛋白Caspase3、PARP無(wú)明顯變化，Bax、Lc3A/B蛋白水平

8、高于對(duì)照組（P<0.01），而B(niǎo)cl-2蛋白含量低于對(duì)照組（P<0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　9. RT-PCR和Western blotting結(jié)果表明spata3慢病毒載體在HEK293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，表明慢病毒載體構(gòu)建成功；
　　10. RT-PCR和Western blotting結(jié)果表明spata3慢病毒載體在GC2-spd細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，spata3過(guò)表達(dá)GC2-spd穩(wěn)定細(xì)胞模型構(gòu)建成功；
　　11

9、. Western blotting結(jié)果表明過(guò)表達(dá)spata3的GC2-spd穩(wěn)定細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Lc3A/B蛋白含量高于對(duì)照組（P<0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　12.細(xì)胞免疫熒光染色分析顯示過(guò)表達(dá)spata3的GC2-spd穩(wěn)定細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Lc3A/B熒光信號(hào)在核周呈點(diǎn)狀廣泛分布；
　　結(jié)論：
　　1. spata3基因在小鼠睪丸組織大量表達(dá)，并具有生精細(xì)胞定位特異性。
　　2.成功建立了sp