生殖細胞特異性轉錄因子SOHLH1及其相關基因在卵巢發(fā)育中的作用.pdf

1、第一章探索Sohlh1下游轉錄調控因子目的：Sohlh1是生殖細胞特異性轉錄調控因子，具有helix-loop-helix(HLH)結構域，Sohlh1基因敲除雌鼠表現(xiàn)為卵細胞過早丟失，卵巢萎縮，成年Sohlh1基因敲除小鼠卵巢僅為正常小鼠卵巢的1/10大，最終以不孕為特點。HLH結構與DNA啟動子區(qū)域E-Box作用元件相結合調控其它基因的轉錄表達，Sohlh1作為HLH家族一員，將其敲除，會導致一系列下游基因失調，從而引起卵巢早衰的表

2、現(xiàn)。本實驗目的在于探討Sohlh1敲除小鼠卵巢的過早衰退的途徑及篩查Sohlh1的下游基因。 方法：通過對減數(shù)分裂影響因子及進入減數(shù)分裂期卵細胞的染色體形態(tài)學分析，并應用基因芯片技術，聯(lián)合比較Sohlh1缺陷新生小鼠卵巢與另外兩個生殖細胞特異因子-Lhx8和Nobox缺陷的新生小鼠卵巢芯片數(shù)據(jù)，分析Sohlh1基因敲除小鼠卵巢異常表型的原因、Sohlh1與Lhx8和Nobox的關聯(lián)作用，篩選下游靶基因。 結論：Sohlh

3、1基因敲除小鼠的卵巢早衰表現(xiàn)不是由于減數(shù)分裂異常所造成；通過基因芯片的應用，我們找到了Sohlh1及其下游通路上的Lhx8、Nobox基因的共同調節(jié)的若干靶基因，對生殖細胞早期發(fā)育的調控通路作了進一步的完善。 第二章Sohlh1轉基因小鼠 目的：Sohlh1作為生殖細胞特異性轉錄因子，在卵泡發(fā)育早期過程中起到了重要作用，其表達具有很強的特異性一僅在小鼠卵巢的卵原細胞、始基卵泡和初級卵泡中表達，而次級卵泡以后則無法檢測到。

4、我們猜想Sohlh1在高級卵泡中的缺失表達是卵泡后期發(fā)育的關鍵，如果過量表達可能會影響到卵細胞的成熟、排卵及受精方面的異常，于是在本章節(jié)的我們的研究目的是構建在次級卵泡中表達Sohlh1的轉基因小鼠，并觀察評價該轉基因鼠的生殖生育能力。 方法：Zp3是另一個對卵泡發(fā)育和精卵結合起重要作用的卵細胞特異表達因子，在小鼠卵巢的各級卵泡中均有表達。據(jù)此，我們應用小鼠Zp3啟動子區(qū)域，將小鼠Sohlh1開放讀碼區(qū)即轉錄區(qū)銜接于mZp3啟動

5、子之后，采用轉基因技術獲得Sohlh1轉基因小鼠。然后對此轉基因鼠進行表型分析。 結論：我們成功構建了Sohlh1于各級卵泡中持續(xù)表達的轉基因小鼠模型，Sohlh1并非卵細胞后期成熟的抑制因子，相反的，Sohlh1的過表達可以促進排卵，或可用于動物繁殖中某些基因型的優(yōu)化。 第三章生殖細胞特異性基因SOHLH1、FIGLA和CDF9在卵巢早衰發(fā)病機制中的作用研究 第一節(jié):美國高加索卵巢早衰患者SOHLH1基因突變篩

6、查 目的：Sohlh1是生殖細胞特異性轉錄調控因子，具有helix-loop-helix(HLH)結構域，Sohlh1基因敲除雌鼠表現(xiàn)為始基卵泡向初級卵泡的發(fā)育障礙，卵細胞過早丟失，卵巢萎縮，不能生育。Sohlh1基因敲除小鼠的表現(xiàn)型極似人類卵巢早衰的疾病表現(xiàn)，于是推想人類SOHLH1基因突變可能與卵巢早衰發(fā)病有關。 方法：選擇96例美國高加索人種POF患者及同類人種對照96人，應用PCR擴增直接測序的方法，對SOHLH

7、1基因的7個外顯子包括5’端和3’端非翻譯區(qū)(UTR)及相應側翼序列進行突變篩查。 結論：c.423A＞G所致的K120R，在靈長目動物中屬于保守序列，可能會與POF的發(fā)病有一定關系；另外，3'UTR是microRNA的結合部位，SOHLH1基因3'UTR所出現(xiàn)的大量SNPs改變，很可能會影響到一系列microRNA的靶定結合，從麗致SOHLH1的表達失衡，這或可是導致卵細胞過早丟失的另一原因，有待于進一步的研究。 第二

8、節(jié):中國漢族卵巢早衰患者FIGLA基因突變篩查 目的：卵巢早衰(POF)是引起高促性腺激素性不孕的一常見疾病，在女性人群中的發(fā)病率為1-2％。卵巢早衰的病因具有多樣性，部分原因仍考慮為單基因突變引起。 而FIGLA，是目前所知的最早調控卵細胞發(fā)育成熟的轉錄因子，F(xiàn)igla基因缺陷雌性小鼠卵巢中無法形成始基卵泡，亦無卵細胞透明帶形成，故推測FIGLA基因突變可能會關系至POF。 方法：選擇就診于我們生殖中心的100

9、例漢族POF婦女，及304例對照進行血樣DNA提取，PCR特異擴增包含有FIGLA的5個外顯子的區(qū)域，進行直接測序(ABI PrismSequencer 3130XL Applied Biosystems)；后應用酵母雙雜交實驗證實其中一缺失突變影響FILGA與TCF3的結合。 結論：在中國漢族的POF人群中，有部分的發(fā)病與基因FIGLA突變有關。 第三節(jié):中國漢族卵巢早衰患者GDF9基因突變篩查 目的：卵巢早衰

10、(Premature Ovarian Failure，POF)是指青春期后、40歲以前發(fā)生的非生理性的月經(jīng)停止，伴有促卵泡素(FSH)、黃體生成素(LH)水平的升高、雌激素(E2)水平的下降以及臨床上表現(xiàn)的潮熱、不育和生殖器官的萎縮等綜合癥。而生長分化因子9(GDF9)是由卵細胞分泌的，對卵泡發(fā)育起重要作用的生殖細胞生長因子。本研究旨在探求基因GDF9突變是否與國人POF有關。 方法：收集2003年5月～2006年5月在山東大學

11、山東省立醫(yī)院生殖醫(yī)學中心就診的卵巢早衰患者100例，及有正常生育史和月經(jīng)史對照96人的外周血。其中卵巢早衰患者的采集符合如下標準：年齡在40歲以下，超過3個月經(jīng)周期無月經(jīng)來潮；至少兩次不同日血清FSH＞40 IU/L，陰道B超監(jiān)測雙側卵巢未見儲備卵泡，并除外染色體異常及免疫性疾病。提取外周血DNA，于GDF9編碼區(qū)設計3對特異性引物行PCR擴增，先用變性高效液相色譜法(Denaturing High-Performance Liquid

12、 Chromatography，DHPLC)檢測是否存在雜合雙鏈。如果檢測出雜合雙鏈，再用PCR產(chǎn)物直接測序尋找突變位點。 結論：我們在100例POF患者中發(fā)現(xiàn)了6個位點的突變，其中4個為新發(fā)突變，2個為已知突變。新發(fā)現(xiàn)突變中兩個也同樣出現(xiàn)在對照組中，未出現(xiàn)在對照組中的一個(c.588A＞C)為同義突變，另一個c.712A＞G致丙氨酸錯譯為蘇氨酸(p.Thr238Ala)，該位點屬于GDF9蛋白編碼功能保守區(qū)，推測此突變可能會影