HuMSCs對(duì)不育小鼠生殖細(xì)胞、支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控研究.pdf

1、【背景與目的】：近數(shù)十年來(lái)，男性不育越來(lái)越為人們所關(guān)注，雖然男性不育的診斷、藥物治療及社會(huì)管理等方面在不斷進(jìn)步，尤其是輔助生殖技術(shù)的成熟推廣，許多患者圓了自己的生育夢(mèng)。但前提是這些不育患者必須能夠產(chǎn)生具有一定數(shù)量并且有功能的生殖細(xì)胞，而對(duì)于那些不能產(chǎn)生具有正常功能的生殖細(xì)胞或健全的單倍體精子的不育患者，干細(xì)胞移植治療是其理想選擇。我們的前期研究表明，HUMSCs在體外能夠向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化，移植到不育小鼠體內(nèi)后能夠分化表達(dá)生殖細(xì)胞標(biāo)記，

2、能夠促進(jìn)不育小鼠睪丸組織修復(fù)。本研究旨在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)不育小鼠睪丸生殖細(xì)胞、支持細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的作用。
　　【材料與方法】：（1）采用組織塊貼壁法分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增HUMSCs；（2）采用腹腔內(nèi)單次注射白消安的方法構(gòu)建不育小鼠模型；（3）通過(guò)顯微注射法將 HUMSCs移植到不育小鼠睪丸曲細(xì)精管內(nèi)，移植后常規(guī)飼養(yǎng)；（4）分別于移植后第1周、2周、1月、2月解剖收取小鼠睪丸；（5）采用組織病理切片和免

3、疫熒光顯微鏡下觀察的方法來(lái)觀察 HuMSCs在曲細(xì)精管內(nèi)的存活、分布及分化情況，qRT-PCR檢測(cè)生殖細(xì)胞、SCs、LCs特異性標(biāo)記在睪丸組織中的表達(dá)情況。
　　【結(jié)果】：（1）采用組織塊貼壁法，用無(wú)血清培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)、擴(kuò)增HUMSCs能正常生長(zhǎng)2個(gè)月以上；（2）腹腔內(nèi)單次注射白消安4周后，小鼠睪丸體積明顯縮小，包膜松弛，管腔變小、質(zhì)脆，鏡下見(jiàn)生精上皮損傷，生精細(xì)胞脫落，絕大部分管腔呈“空泡樣”改變，不育小鼠模型構(gòu)建成功；（3）

4、通過(guò)顯微注射法成功將細(xì)胞移植到小鼠睪丸曲細(xì)精管，移植1周后HuMSCs主要存在于睪丸曲細(xì)精管的官腔內(nèi)，且有逐漸向基底膜移行的趨勢(shì)，1月后即可觀察到細(xì)胞分布在生精上皮近基底膜處，2月時(shí)定植于基底膜；（4）不育小鼠移植HUMSCs后，大體觀下睪丸體積較陰性對(duì)照增大（p<0.05），鏡下見(jiàn)生殖細(xì)胞增生恢復(fù)加快；（5）qRT-PCR結(jié)果顯示，HUMSCs移植后1、2月，HUMSCs移植組生殖細(xì)胞標(biāo)記Ddx4表達(dá)水平明顯升高，與陰性對(duì)照組有顯著性

5、差異（p<0.05）；移植后不成熟SCs標(biāo)記Amh的表達(dá)水平明顯升高，與陰性對(duì)照組有顯著性差異（p<0.05）；移植后1、2周、1月，成熟SCs標(biāo)記Ar的表達(dá)水平明顯升高，與陰性對(duì)照組有顯著性差異（p<0.05）,2月時(shí)無(wú)明顯差異（p>0.05）；fetal LCs標(biāo)記Lhcgr在移植后1、2周時(shí)較陰性對(duì)照組明顯升高（p<0.05），1、2月時(shí)則降低（p<0.05）；adult LCs標(biāo)記Hsd-3b1在移植后1、2周時(shí)較陰性對(duì)照組明顯

6、升高（p<0.05），1月時(shí)降低（p<0.05），2月時(shí)無(wú)明顯差異（p>0.05）。
　　【結(jié)論】：（1）采用無(wú)血清培養(yǎng)體系，運(yùn)用組織塊貼壁法，HuMSCs體外擴(kuò)增培養(yǎng)能正常生長(zhǎng)至少2個(gè)月；（2）HUMSCs移植不育小鼠曲細(xì)精管后能夠存活并發(fā)生遷移，1月后分布在生精上皮近基底膜處，2月時(shí)定植于基底膜；（3）HUMSCs對(duì)不育小鼠生殖細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，并持續(xù)增強(qiáng)；（4）HUMSCs對(duì)支持細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，但2周后逐漸減弱；（5