鈣蛋白酶抑制劑拮抗丙烯酰胺染毒大鼠脊髓神經(jīng)絲變化及其機(jī)制.pdf

1、目的
　　丙烯酰胺(acrylamide，ACR)應(yīng)用廣泛，以它為單體作為原料合成的工業(yè)產(chǎn)品多達(dá)百種。ACR能誘發(fā)中樞-周圍神經(jīng)病。臨床表現(xiàn)有出汗、手腳感覺異常、腿部痙攣、白指、皮膚刺激和皮膚剝落等，之后表現(xiàn)為骨骼肌無力和四肢麻痹。ACR誘導(dǎo)的病變尚無定論，國內(nèi)外研究多集中于神經(jīng)元軸索，但是近年來國內(nèi)外學(xué)者研究表明ACR誘導(dǎo)的細(xì)胞Ca2+內(nèi)流，鈣依賴性蛋白酶活性升高，病理特征顯示軸突內(nèi)腫脹和神經(jīng)絲堆積。本研究之前以建立ACR中毒模

2、型，發(fā)現(xiàn)組織內(nèi)的神經(jīng)絲(neurofilaments，NFs)發(fā)生了明顯改變。但其中NFs是如何改變的尚不清楚。我們假設(shè)這種NFs的改變與Calpain有關(guān)，為驗(yàn)證這種假設(shè)，本研究通過建立ACR中毒神經(jīng)病大鼠模型及鈣蛋白酶抑制劑(Calpeptin，CP)干預(yù)模型，測定大鼠神經(jīng)行為學(xué)的變化及脊髓組織中Ca2+、Calpain活性、NFs蛋白表達(dá)水平，為研究ACR引起的神經(jīng)病變的發(fā)病機(jī)制和預(yù)防措施提供理論依據(jù)。
　　方法
　　

3、1.動物模型及行為觀察將30只成年雌性Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為3組，即對照組、模型組和干預(yù)組(n=10)。ACR溶解生理鹽水中，模型組和干預(yù)組按30mg/kg·bw經(jīng)腹腔注射染毒，對照組給予等體積生理鹽水。干預(yù)組在注射ACR1h后，給予Calpeptin200μg/kg·bw，每3次/周，連續(xù)4周。于第4周，斷頭處死大鼠，取大腦、脊髓備用。每周測體重及神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo)1次。
　　2.神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo)測定給抑制劑期間測

4、定不同時間點(diǎn)各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo):步態(tài)評分、后肢撐力指數(shù)。
　　3.分離脊髓，胰酶消化后，F(xiàn)ura-2/AM裝載后用熒光分光光度計(jì)測定鈣離子含量。
　　4.取脊髓經(jīng)組織勻漿上清，加CalpainsubstrateⅡ，用酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度，得出Calpain活性。
　　5.蛋白免疫印跡(Westemblotting)測定脊髓組織中的NF-L、NF-M蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果
　　1.大鼠一般狀況變化對照組大

5、鼠體重平穩(wěn)增長;模型組大鼠體重增長較為緩慢，兩者體重于第2周開始出現(xiàn)顯著差異(P＜0.05);干預(yù)組大鼠體重在第2周時體重顯著高于模型組(P＜0.05)。
　　2.大鼠神經(jīng)行為學(xué)改變模型組大鼠腹部著地，兩腿叉開平鋪、劃行、呈鴨步，干預(yù)組出現(xiàn)不同程度的步態(tài)異常，后肢間距增寬，但異常程度較模型組輕，其中模型組步態(tài)評分呈3分的占60％，干預(yù)組2-3分大鼠分別占80％和20％，與模型組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。后肢撐力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯

6、示，模型組大鼠后肢間距比對照組明顯增寬(P＜0.01)，干預(yù)組大鼠后肢間距明顯比模型組降低，到第4周，干預(yù)組大鼠后肢間距比模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05)。
　　3.大鼠脊髓組織Ca2+變化與對照組相比，模型組和干預(yù)組分別升高了25.34％和17.03％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;與模型組比較，干預(yù)組降低了6.63％差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.大鼠Calpain活性的改變與對照組比，模型組脊

7、髓Calpain活性升高了33.33％（P＜0.01），干預(yù)組升高了15.87％(P＜0.01);與模型組比，干預(yù)組脊髓Calpain活性降低了13.10％（P＜0.05）。
　　5.大鼠脊髓神經(jīng)絲蛋白改變與對照組相比，模型組NF-L、NF-M分別升高了30.0％、60.9％（P＜0.05），干預(yù)組NF-L、NF-M分別升高了14.1％和25.9％（P＜0.05）。與模型組相比，干預(yù)組的NF-L、NF-M分別下降了12.6％和21