攜帶定點(diǎn)固載標(biāo)簽的人PTH表達(dá)純化及其納米抗體的淘選.pdf

1、人體內(nèi)過多的甲狀旁腺激素(PTH)會造成繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)(SHPT)從而引發(fā)多系統(tǒng)病變，加重腎衰患者病情。目前，臨床上降低PTH的方法有藥物、手術(shù)、血液凈化三種治療方式。前兩者副作用很大，間接加重腎臟的負(fù)擔(dān)，而目前存在的血液凈化方法對PTH的去除能力差，費(fèi)用高，因此開發(fā)特異性的高親和性吸附材料十分必要。納米抗體具有獨(dú)特的優(yōu)勢，是配基材料的最佳選擇。目前利用噬菌體展示庫篩選抗體的方法比較成熟，但是傳統(tǒng)方法中利用疏水作用固載抗原篩選抗

2、體會使蛋白二維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因此并不適用于親水性的小分子蛋白類抗原。本研究將定點(diǎn)固載技術(shù)引入抗體篩選過程，可以保持抗原的天然構(gòu)象。本論文嘗試了兩種用于定點(diǎn)固載的標(biāo)簽，經(jīng)過比較，采用后者成功篩選出了抗人PTH的納米抗體。研究內(nèi)容如下:
　　(1)帶醛基的PTH的制備。利用合成的方法獲得了甲酰甘氨酸生成酶(FGE)及帶醛基標(biāo)簽前體的PTH的基因，并構(gòu)建了一系列載體，嘗試了體外催化和體內(nèi)共表達(dá)催化兩種醛基生成的策略，最后利用不相容質(zhì)粒的

3、共表達(dá)體系得到了帶有醛基標(biāo)簽的目的蛋白，但帶醛基的蛋白產(chǎn)量低，尚需深入研究。
　　(2)帶巰基的PTH的制備。利用PCR技術(shù)在PTH的碳末端外加一個半胱氨酸，構(gòu)建載體pET23a-PTH-C，在腸桿菌中實現(xiàn)了可溶表達(dá)，表達(dá)量在25％-30％之間，經(jīng)過粗分離和陽離子交換層析，得到了純度95％以上的終產(chǎn)品，利用Ellman試劑定性檢測，證實了存在自由巰基。
　　(3)定點(diǎn)固載抗原法篩選納米抗體。依據(jù)研究結(jié)果，利用巰基標(biāo)簽固載抗原