1、特異性結合DON抗原-抗體免疫復合物納米抗體的淘選、鑒定及表達2、基于噬菌體展示納米抗體的定量免疫PCR檢測Bt蛋白Cry1Ac方法的建立.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、本文分為二部分:
  第一部分:
  相對于競爭型免疫分析體系,非競爭型免疫分析方法具有操作簡單、靈敏度高以及檢測范圍廣等優(yōu)點。然而,對于小分子物質而言,由于小分子物質的分子量及結合表位較小,難以直接被兩個常規(guī)抗體同時結合,因此目前小分子物質的免疫分析體系大多以競爭型為主。本研究以食品中常見的真菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)為小分子物質的研究模型,在形成DON抗原-抗體免疫復合物的基礎上,投

2、入天然噬菌體展示納米抗體庫,親和淘選可特異性結合DON抗原-抗體復合物的噬菌體展示納米抗體,經(jīng)Phage-ELISA驗證后,開展納米抗體的可溶性原核表達,為建立基于納米抗體的DON非競爭型免疫分析體系提供了一種新的途徑和有效探索。本研究取得的主要實驗結果如下:
  1.可特異性結合DON抗原-抗體免疫復合物納米抗體的親和淘選及鑒定
  以DON為研究對象,DON抗原-抗體免疫復合物作為靶標,經(jīng)過四輪親和淘選,從駝源天然噬菌體

3、展示納米抗體庫中首次獲得4種可特異性結合DON抗原-抗體免疫復合物的納米抗體,經(jīng)DNA測序分析后,分別命名為P-1、P-19、P-26、P-46,Phage-ELISA結果顯示,上述納米抗體對DON抗原-抗體復合物具有良好的結合特異性;建立了基于噬菌體展示納米抗體(P-26)的非競爭型免疫分析DON曲線,結果顯示:當DON標準品的濃度在0~500 ng/mL區(qū)間時,投入了所獲噬菌體展示納米抗體的對應板孔,其OD值隨著加入的DON濃度增加

4、而相應地提高,表明所獲得的噬菌體展示納米抗體對DON抗原-抗體復合物具有較好的結合響應度,但未呈現(xiàn)典型的線性曲線。
  2.可特異性結合DON抗原-抗體免疫復合物納米抗體的原核表達
  通過分子克隆技術,提取P-1、P-19、P-26、P-46的VHH編碼基因,將編碼基因克隆至pET25b(+)原核表達載體上,經(jīng)DNA測序驗證,成功構建了重組表達載體pET25b-VHH-P-1、pET25b-VHH-P-19、pET25b-

5、VHH-P-26和pET25b-VHH-P-46,并轉化至E.coli Rosetta細胞;在1%葡萄糖,0.05 mM IPTG下誘導表達8 h,經(jīng)鎳柱純化,并用50 Mm咪唑洗脫后,獲得4種可溶性的納米抗體N-1、N-19、N-26、N-46。建立了基于可溶性納米抗體(N-26)的DON非競爭型免疫分析反應曲線,當DON標準品的濃度在8~100 ng/mL區(qū)間時,投入了納米抗體的對應板孔,其OD值隨著加入的DON濃度增加而相應地提高

6、,表明所獲得的可溶性納米抗體對DON抗原-抗體復合物具有較好的結合響應度,為下一步開展DON的非競爭型免疫分析體系的建立提供了重要研究材料及有效地探索。
  第二部分:
  Cry1Ac是一種常見的Bt(Bacillus thuringiensis,Bt)蛋白,現(xiàn)已廣泛應用于抗蟲轉基因作物,比如大豆、棉花、水稻、小麥等。隨著眾多轉基因農(nóng)作物的逐漸商業(yè)化,市場上的轉基因食品日益增多,同時轉基因食品的安全性也逐漸受到大眾的關注及

7、重視,因此對食品中的轉基因成分進行檢測就顯得十分重要。目前轉基因成分(Genetically modified ingredients,GMO)的檢測主要包括基于蛋白質檢測的免疫分析以及基于核酸檢測的PCR(Polymerase chain reaction,PCR)分析兩大類。免疫分析具有特異性高、操作簡單以及可高通量篩選等優(yōu)點,然而由于其自身信號擴增體系的局限性,也存在著靈敏度不高、假陽性較多等缺陷。本研究在獲得可特異性結合Cry1

8、Ac蛋白的噬菌體展示納米抗體的基礎上,將免疫分析與核酸分析的技術優(yōu)勢進行綜合,建立基于噬菌體DNA信號擴增體系的免疫PCR分析Cry1Ac蛋白方式,主要實驗結果如下:
  1.針對抗Cry1Ac噬菌體展示納米抗體編碼基因的CDR3區(qū)設計了特異性的PCR擴增引物,成功地擴增了納米抗體的CDR3區(qū)(98 bp),為噬菌體展示納米抗體的特異性信號擴增奠定了基礎。
  2.將抗Cry1Ac單克隆抗體(8A8)作為捕獲抗體,抗Cry1

9、Ac噬菌體展示納米抗體(P-72)作為檢測抗體,建立了轉基因蛋白Bt-Cry1Ac的免疫PCR檢測方法。該方法的擬合標準曲線結果顯示,其線性相關系數(shù)為0.9968,線性范圍為0.001~100 ng/mL,最低檢測限為0.094 pg/mL;該方法對于Cry1Ac的同源蛋白Cry1Ab的交叉反應率為3.4%,對其它雜類蛋白質無交叉反應,具備良好的檢測特異性;加標回收實驗結果顯示,該方法用于檢測Bt-Cry1Ac的加標回收率為78.81~

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