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文檔簡介
1、目的:
LRRK2是近年來受關(guān)注較多的一個帕金森病(PD)相關(guān)基因。是一個會導(dǎo)致遺傳性帕金森病的最為常見的常染色體顯性遺傳帕金森病基因,可能導(dǎo)致了約7%家族遺傳性帕金森病,它的突變與散發(fā)性PD也有一定的聯(lián)系,遺傳性突變引起的LRRK2激酶活性增高是目前比較公認(rèn)的帕金森病發(fā)病機(jī)制之一,并正在指導(dǎo)著臨床藥物的開發(fā)。大黃素和槲皮素在我們實(shí)驗(yàn)室的前期實(shí)驗(yàn)已證明是在體外能有效抑制LRRK2激酶活性的具有激酶活性抑制作用的中草藥制劑。本實(shí)
2、驗(yàn)選用相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因果蠅品系對大黃素和槲皮素進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究,檢驗(yàn)其在體實(shí)驗(yàn)時有無激酶活性抑制作用,并選出作用最好的濃度值,進(jìn)一步實(shí)驗(yàn),研究其作用的途徑。
方法:
1.使用Ddc-GAL4;UAS-LRRK2-G2019S品系果蠅(簡稱GS2),給予不同濃度的大黃素和槲皮素,與對照組比較,檢測生命周期和運(yùn)動能力,篩選出合適的藥物濃度,觀察生命周期和運(yùn)動能力出現(xiàn)重大變化的時間段,進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。
2.使用GS
3、2品系果蠅作為實(shí)驗(yàn)組,Ddc-Gal4品系果蠅(簡稱GAL4)作為陰性對照組。飼養(yǎng)至一定時間,取果蠅頭部,提取蛋白,用Western blot檢測p-LRRK2、Nrf2、GCLC、p-p38MAPK、ERK、TH等表達(dá)的變化,確定大黃素和槲皮素提高LRRK2突變致PD果蠅的壽命和運(yùn)動能力的可能途徑。
結(jié)果:
1.大黃素實(shí)驗(yàn)組:
生命周期:濃度為100μmol/l的大黃素果蠅壽命延長最明顯。并且40天左右曲
4、線出現(xiàn)明顯改變。半數(shù)生存時間顯示濃度為100μmol/l的大黃素實(shí)驗(yàn)組有意義。
運(yùn)動能力:濃度為100μmol/l的大黃素果蠅的運(yùn)動能力(攀爬)改善最明顯,數(shù)據(jù)統(tǒng)計在第四、第五、第六、第七周有意義。在第六周意義更為明顯。
2.槲皮素實(shí)驗(yàn)組:
生命周期:濃度為10μmol/l的實(shí)驗(yàn)組和濃度為1μmol/l的實(shí)驗(yàn)組的效果是有重合的,但在40天左右時,10μmol/l實(shí)驗(yàn)組的效果明顯優(yōu)于1μmol/l實(shí)驗(yàn)組。各組
5、曲線均在40天左右出現(xiàn)明顯改變。半數(shù)生存時間顯示濃度為1μmol/l和10μmol/l的實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)都有意義。
運(yùn)動能力:濃度為10μmol/l的槲皮素實(shí)驗(yàn)組的效果最明顯。數(shù)據(jù)統(tǒng)計在第三、第四、第五、第六周皆有意義,且在第六周意義更為顯著。
3.使用大黃素、槲皮素后磷酸化LRRK2的表達(dá)量降低;Nrf2和GCLC的表達(dá)量均有增加;磷酸化p38MAPK的表達(dá)量降低。ERK的表達(dá)量要低于未用藥實(shí)驗(yàn)組。TH的表達(dá)量增高。
6、r> 結(jié)論:
1.給藥濃度為100μmol/l的大黃素和10μmol/l的槲皮素的效果相對比較明顯。生命周期和運(yùn)動能力都是在40天左右,也即是在第六周時出現(xiàn)明顯改變。
2.大黃素和槲皮素可能是經(jīng)由:
通過激活Nrf2,引起Nrf2的核轉(zhuǎn)移,繼而提高GCLC基因表達(dá),增加GSH的表達(dá),產(chǎn)生抗氧化作用,提高細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的能力,保護(hù)了DA神經(jīng)元功能,對PD起到一定的治療作用。
通過抑制p38MAPK
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