microRNAs對(duì)帕金森病致病基因LRRK2表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、第一部分LRRK2基因相關(guān)microRNAs的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證
　　帕金森病(Parkinson Disease，PD)是一種常見的神經(jīng)變性疾病。PD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前認(rèn)為其是由遺傳因素與環(huán)境因素的共同作用所導(dǎo)致的。PD遺傳致病機(jī)制的研究已取得明顯進(jìn)展，迄今已定位16個(gè)PD相關(guān)位點(diǎn)，克隆了包括富亮氨酸重復(fù)激酶2基因(Leucine-rich repeat kinase2，LRRK2)在內(nèi)的11個(gè)致病基因，LRRK2不僅是常染色體顯

2、性遺傳性PD重要致病基因，還與部分原發(fā)性PD有關(guān)。
　　目前LRRK2基因突變導(dǎo)致PD發(fā)生的機(jī)制并不十分清楚，但研究提示某些LRRK2致病突變（如G2019S）可能引起其激酶功能增強(qiáng)而具有細(xì)胞毒性，并且過表達(dá)野生型LRRK2也具有細(xì)胞毒性作用。此外LRRK2可能參與PD發(fā)生過程中異常蛋白沉積。過表達(dá)野生型LRRK2、LRRK2-G2019S突變體或LRRK2激酶結(jié)構(gòu)域可加速α-Synuclein A53T的聚集。由此可見，對(duì)LRR

3、K2的表達(dá)和功能的精確調(diào)控在PD發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。
　　MicroRNA(miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為21-23個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成，有5'端磷酸基和3'羥基，定位于RNA前體的3'端或5'端。在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異，這種miRNAs表達(dá)模式具有分化的位元相性和時(shí)序性(differentia

4、l spatial and temporal expression pattems)，因此miRNAs作為參與調(diào)控基因表達(dá)的分子具有重要意義。本課題將探討miRNA對(duì)LRRK2基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制在PD發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法:通過UCSC Genome Bioinformatics數(shù)據(jù)庫(kù)(http://genome.ucsc.edu/)查詢LRRK2基因的RefSeq序列，根據(jù)查詢到的LRRK2基因3，UTR序列運(yùn)用target

5、scan（http://www.targetscan.org/），miRanda（http://www.microrna.org/microma/home.do)等根據(jù)LRRK2基因3'UTR序列預(yù)測(cè)能對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的microRNAs，從miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)獲得相關(guān)microRNAs序列，比對(duì)生物信息學(xué)軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果，選擇評(píng)分值高的microRNAs進(jìn)行生物學(xué)驗(yàn)證。構(gòu)建野生型及突變型LRRK2基因3'UTR序列熒光素酶報(bào)告基因載體

6、，在N2a細(xì)胞中與miRNAs瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染，于轉(zhuǎn)染后24小時(shí)及48小時(shí)進(jìn)行熒光素酶活性分析，驗(yàn)證miRNAs對(duì)LRRK2基因mRNA的轉(zhuǎn)錄后抑制作用。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miRNAs進(jìn)入HEK293細(xì)胞系，于轉(zhuǎn)染后24小時(shí)及48小時(shí)檢測(cè)內(nèi)源性LRRK2蛋白表達(dá)水平。根據(jù)共轉(zhuǎn)microRNA后熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)活性以及細(xì)胞系體內(nèi)的內(nèi)源性LRRK2蛋白表達(dá)水平判斷，二者均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)判定該microRNA分子對(duì)LRRK2基因具有轉(zhuǎn)路后抑制作用。

7、　　結(jié)果:本研究對(duì)LRRK2基因的RefSeq序列NM_198578的全長(zhǎng)3'UTR序列共1517個(gè)堿基進(jìn)行分析，以蛋白翻譯終止位點(diǎn)“TAG”的G堿基為+1位進(jìn)行描述，結(jié)合TargetScan預(yù)測(cè)結(jié)果顯示hsa-miR-205與LRRK2基因3'UTR序列結(jié)合位點(diǎn)+116-122具有高保守性，107個(gè)人類miRNAs分子與人類LRRK2基因3'UTR序列存在保守性較低的潛在結(jié)合性;miRanda預(yù)測(cè)結(jié)果顯示57個(gè)人類miRNAs分子與人

8、類LRRK2基因3'UTR序列存在潛在結(jié)合性，選取23個(gè)潛在調(diào)控miRNAs進(jìn)行生物學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果顯示hsa-miR-205 mimics與攜帶野生型LRRK2基因3'UTR序列以及位點(diǎn)+116-122突變型LRRK2基因3'UTR序列的Luc報(bào)告系統(tǒng)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞株后，攜帶野生型組的Luc報(bào)告基因相對(duì)活性下降，t檢驗(yàn)顯示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，t=6.479，95％CI值為-1.614～-0.617）;hsa-miR-4

9、54 mimics與構(gòu)建的攜帶野生型LRRK2基因3'UTR序列以及位點(diǎn)+506-512突變型LRRK2基因3'UTR序列的Luc報(bào)告系統(tǒng)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞株后，野生型組的Luc報(bào)告基因相對(duì)活性明顯下降，t檢驗(yàn)顯示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001，t=6.479，95％CI值為-1.614～-0.617)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染hsa-miR-205、hsa-miR-301b及hsa-miR-454 mimics進(jìn)HEK293細(xì)胞于24小時(shí)及48

10、小時(shí)檢測(cè)內(nèi)源性LRRK2表達(dá)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染hsa-miR-205mimics后內(nèi)源性LRRK2蛋白生成明顯減少，轉(zhuǎn)染hsa-miR-454 mimics后內(nèi)源性LRRK2蛋白生成減少，而轉(zhuǎn)染hsa-miR-301b mimics后HEK293細(xì)胞的內(nèi)源性LRRK2蛋白減少不明顯。
　　結(jié)論:hsa-miR-205可與LRRK2基因3'UTR序列的5，-AUGAAGG-3'互補(bǔ)結(jié)合，抑制LRRK2基因的表達(dá);hsa-miR-454可

11、與LRRK2基因3，UTR序列的5'-UUGCACU-3'互補(bǔ)結(jié)合，抑制LRRK2基因的表達(dá);hsa-miR-301b可能與LRRK2基因3'UTR序列的5'-UUGCACU-3'互補(bǔ)結(jié)合，抑制LRRK2基因的表達(dá)，但仍需深入研究。
　　第二部分miRNAs及LRRK2 mRNA在干細(xì)胞-神經(jīng)元分化細(xì)胞系的表達(dá)水平研究
　　組織發(fā)育與生理過程中的穩(wěn)態(tài)通過于細(xì)胞與組織干細(xì)胞的調(diào)控完成，是否存在一些細(xì)胞內(nèi)機(jī)制介導(dǎo)干細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)

12、導(dǎo)、表觀遺傳，轉(zhuǎn)錄，翻譯以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控水平的分化基因表達(dá)等細(xì)胞內(nèi)機(jī)制。microRNA，作為基因表達(dá)、修飾、轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)者，在干細(xì)胞的自我復(fù)制、定向分化和組織再生中起著十分重要的作用。它是干細(xì)胞特性、維持、轉(zhuǎn)化功能的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控者，參與細(xì)胞周期、細(xì)胞重建(Reprograming)、多能干細(xì)胞生成、信號(hào)傳遞、特異分化、聚集、修復(fù)、再生、變異、代謝等所有過程，是當(dāng)前干細(xì)胞調(diào)控研究的一個(gè)重點(diǎn)。
　　LRRK2基因是PD發(fā)病的重要致

13、病基因，而病理學(xué)研究表明LRRK2蛋白廣泛表達(dá)于所有腦組織，但以多巴胺能神經(jīng)支配區(qū)為主。對(duì)大鼠的胚胎發(fā)育中神經(jīng)元與神經(jīng)元附屬組織的LRRK2 mRNA表達(dá)研究表明LRRK2可能在控制神經(jīng)元細(xì)胞的增殖、遷移以及分化過程中發(fā)揮作用。本章節(jié)將在驗(yàn)證miR-454及miR-205對(duì)LRRK2基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的基礎(chǔ)上初步探討miR-454及miR-205與LRRK2在胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化過程中不同分化階段胚胎干細(xì)胞及胎腦組織的表達(dá)之間的相關(guān)性，

14、為進(jìn)一步深入研究miRNAs與LRRK2在神經(jīng)元增殖、遷移以及分化過程中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法:分化人源胚胎干細(xì)胞hESCs H9-P57細(xì)胞(ES)，分別收集ES，擬胚體(EB)，神經(jīng)前體細(xì)胞以及人類胎腦組織共3個(gè)不同胚胎發(fā)育階段的細(xì)胞及組織，提取總RNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miRNAs，LRRK2基因mRNA的表達(dá)水平;提取胎腦組織蛋白，應(yīng)用western blotting技術(shù)檢測(cè)胎腦組織中LRRK2蛋白的表達(dá)水平

15、。
　　結(jié)果:相對(duì)定量PCR結(jié)果顯示LRRK2 mRNA在胚胎分化的前期到神經(jīng)前體細(xì)胞階段表達(dá)均很低，在擬胚體階段甚至檢測(cè)不到LRRK2 mRNA，而在發(fā)育到26周的有成熟神經(jīng)元細(xì)胞存在的胎腦組織中LRRK2 mRNA則呈現(xiàn)高表達(dá)，其中以包含大腦皮質(zhì)及髓質(zhì)結(jié)構(gòu)的組織表達(dá)最高，僅有皮質(zhì)結(jié)構(gòu)的腦組織表達(dá)量較前者低，而在小腦中則表達(dá)更低;miR-454在胚胎干細(xì)胞，擬胚體階段以及神經(jīng)前體細(xì)胞階段的表達(dá)均較低，而在發(fā)育到26周的胎腦組織中

16、表達(dá)則升高，在胎大腦組織（包括大腦皮質(zhì)及髓質(zhì)）中的表達(dá)多于大腦皮層組織內(nèi)的表達(dá)，大腦皮質(zhì)及小腦組織中miR-454表達(dá)水平相當(dāng);miR-205在胚胎干細(xì)胞，擬胚體階段存在表達(dá)，神經(jīng)前體細(xì)胞階段基本沒有miR-205的表達(dá)，但在發(fā)育到26周的胎腦組織中均有表達(dá)，在胎大腦組織（包括大腦皮質(zhì)及髓質(zhì)）相對(duì)較低，而小腦中表達(dá)相對(duì)較高。胎小腦組織中LRRK2蛋白表達(dá)最高，胎大腦組織（包括大腦皮質(zhì)及髓質(zhì)）相對(duì)較低，僅包含皮質(zhì)的胎腦組織中表達(dá)最低。

17、r>　　結(jié)論:miR-454及miR-205在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在表達(dá);miR-205在胚胎干細(xì)胞分化過程中存在表達(dá)。
　　第三部分帕金森病患者血清miRNAs表達(dá)水平檢測(cè)
　　miRNAs是一類內(nèi)源性表達(dá)的短小的，非編碼RNAs，可通過調(diào)控眾多基因表達(dá)在不同生理功能中發(fā)揮作用。miRNAs主要與靶基因的mRNAs的3'UTR序列的結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合通過降解靶基因的mRNAs或者減少靶基因蛋白翻譯而達(dá)到轉(zhuǎn)錄后抑制作用。目前研究顯示

18、miRNAs表達(dá)異常與眾多疾病的發(fā)生相關(guān)， miRNAs的表達(dá)異?？赡茏鳛闈撛诘募膊≡\斷標(biāo)志物或者與疾病相關(guān)的miRNAs可能成為潛在的疾病治療靶點(diǎn)。多項(xiàng)研究顯示人類血清或者血漿中存在由組織釋放的游離miRNAs，并且這些游離miRNAs表達(dá)具有穩(wěn)定性，可再生性，在同一個(gè)體中表達(dá)水平一致，并不易被自身血液系統(tǒng)中的RNAse酶降解等特性，研究表明一些疾病如肺癌、前列腺癌等患者血清中游離miRNAs與正常人比較表達(dá)存在差異，因此目前認(rèn)為血清

19、中的miRNAs可能作為診斷癌癥等某些疾病的標(biāo)志物。
　　多年來，眾多研究組致力于尋找準(zhǔn)確診斷PD的生物標(biāo)志物與生理學(xué)檢查，但是目前并沒有找到確鑿的診斷標(biāo)志物，因此檢測(cè)PD患者腦脊液，或者血液中的miRNAs水平看是否能作為包括PD在內(nèi)的神經(jīng)變性病的診斷標(biāo)志物或者治療靶點(diǎn)。本研究在前面章節(jié)的研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢測(cè)PD患者與正常對(duì)照血清中是否存在游離miR-205及miR-454水平差異性作為一種尋找PD生物標(biāo)志物的探索性研究。

20、r>　　方法:采集16例散發(fā)性PD患者以及20例正常對(duì)照者5ml靜脈血，促凝管靜置4-6小時(shí)，分離血清于-70℃保存，應(yīng)用Ambion-mirVanaTM PARIS TMkit進(jìn)行游離小RNAs分離，測(cè)OD，應(yīng)用Qiagen公司的microRNAs RT-kit逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用熒光定量PCR定量PD組及對(duì)照組血清中Hsa-miR-205，hsa-miR-454的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:本章研究利用qReal-Time PCR

21、對(duì)16例PD患者及20例健康對(duì)照者的血清中游離miR-205進(jìn)行相對(duì)定量分析，PD患者血清中的miR-205表達(dá)較正常對(duì)照組低，應(yīng)用T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩者差異的P值=0.0001，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;PD患者血清中的miR-454表達(dá)較正常對(duì)照組低，應(yīng)用T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩者差異的P值=0.04，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:PD患者血清中游離miR-205水平較正常對(duì)照明顯減低，miR-205很可能為PD的生物標(biāo)記物;