果蠅LRRK2基因編碼蛋白的純化和抗體的初步檢測.pdf

1、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見于中老年人的進(jìn)行性神經(jīng)變性疾病。其主要臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢反射障礙。大部分帕金森病是散發(fā)性的。隨著α-synuclein、parkin、PINK1、LRRK2等6個PD相關(guān)致病基因的克隆，遺傳因素在PD發(fā)病機(jī)制中的作用越來越受到關(guān)注。在大約2-13％的遲發(fā)型常染色體顯性遺傳的帕金森病患者和0.5-3％的散發(fā)帕金森病患者中檢測到LRRK2基因的突變，

2、因此該基因的發(fā)現(xiàn)具有重大的意義。果蠅作為研究帕金森病的動物模型，其基因組中含有5個已克隆的PD相關(guān)基因。果蠅中有復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)，且神經(jīng)生長和功能在細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)上與人類有極大的相似性。這就使得果蠅成為研究神經(jīng)生長，功能和神經(jīng)機(jī)能障礙的重要模型。 目的：為了能夠深入了解LRRK2基因的功能，了解其在PD發(fā)病機(jī)制中所起的作用，本實驗原核表達(dá)和純化了果蠅LRRK2基因編碼的截短蛋白，經(jīng)誘導(dǎo)并純化后免疫新西蘭雄兔，制備多克隆抗體

3、。 方法：應(yīng)用PCR的方法從果蠅gDNA中擴(kuò)增部分LRRK2基因，構(gòu)建至原核表達(dá)載體中，IPTG誘導(dǎo)后分離純化表達(dá)產(chǎn)物并免疫新西蘭雄兔，制備抗果蠅LRRK2基因編碼蛋白的血清。構(gòu)建pEGFP-N1-dLRRK2真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，通過熒光顯微鏡及Western blotting檢測抗體的特異性。 結(jié)果：成功構(gòu)建pGEX-4T-2-dLRRK2原核表達(dá)載體。得到了高表達(dá)的目的蛋白，經(jīng)純化后得到高純度的G