抑癌蛋白PTEN的去泛素化酶鑒定及PTEN泛素化調(diào)控乳腺癌細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、研究背景與目的
　　人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphataseandtensionhomologuedeletedfromchromosome10，pten，又叫做mmac1或tep1)屬于PTP(proteintyrosinephosphatases)基因家族，定位于人類染色體10q23.3，具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白質(zhì)磷酸酶雙重活性，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)具有雙重磷酸酶活性的抑癌蛋白。PTEN的脂質(zhì)磷

2、酸酶活性能夠特異性地使磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(phosphatidylinositol-3，4，5-triphosphate，PIP3)的3位磷酸基團(tuán)去磷酸化，拮抗磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)的功能，從而抑制PI3K下游Akt信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而產(chǎn)生抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和遷移等生物學(xué)行為的效應(yīng)。目前已知，PTEN蛋白是繼p53之后發(fā)現(xiàn)的與腫瘤關(guān)系最為密切的抑癌蛋白之一，在

3、泌尿系統(tǒng)腫瘤和生殖系統(tǒng)腫瘤等諸多惡性腫瘤中均可檢測(cè)到pten基因的突變或缺失。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)PTEN總蛋白量的減少亦與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。
　　PTEN的研究已經(jīng)成為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)方向，PTEN的生理功能在人類多種腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的重要性已經(jīng)被越來(lái)越多的研究者證實(shí)和承認(rèn)。
　　現(xiàn)有報(bào)道表明，在多種人類腫瘤中能夠檢測(cè)到pten的啟動(dòng)子區(qū)被甲基化修飾使基因表達(dá)受到抑制;pten基因的轉(zhuǎn)錄亦會(huì)受到p53等眾多上

4、游分子的精細(xì)調(diào)節(jié);在轉(zhuǎn)錄后水平，PTEN蛋白的表達(dá)受到非編碼RNAmiR-21及miR-19等的抑制;在翻譯后水平，PTEN可被泛素化、磷酸化和乙?；揎棧瑥亩淖働TEN在細(xì)胞內(nèi)的定位、蛋白的空間構(gòu)象、蛋白穩(wěn)定性和脂質(zhì)磷酸酶活性等3（圖2）。
　　PTEN的功能如此重要，其生理活性和蛋白穩(wěn)定性也會(huì)受到嚴(yán)格而精密的調(diào)控。已有研究報(bào)道在多種人類腫瘤中能夠可檢測(cè)到pten基因啟動(dòng)子被甲基化修飾，從而使基因沉默;在轉(zhuǎn)錄后水平，PTEN蛋

5、白的表達(dá)受到非編碼RNAmiR-21及miR-19等的抑制;在翻譯后水平，PTEN可被泛素化、磷酸化和乙?；揎棧瑥亩淖働TEN的細(xì)胞內(nèi)定位、蛋白空間構(gòu)象、蛋白穩(wěn)定性和自身磷酸酶活性等。
　　泛素化降解與去泛素化修飾的動(dòng)態(tài)平衡在蛋白水平的精細(xì)調(diào)節(jié)中具有重要地位。泛素連接酶(ubiquitinligase，E3)與去泛素化酶(deubiquitinase，DUB)的功能相互拮抗，共同維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的能夠促進(jìn)PT

6、EN泛素化的E3共有5個(gè)分子，分別為Nedd4-1、WWP2、CHIP(CterminusofHsc70-interactingprotein)、XIAP和TRIM27/RFP，而具有促進(jìn)PTEN去泛素化修飾功能的DUB只有HAUSP和USP13被發(fā)現(xiàn)。其中HAUSP只能夠特異性地去除PTEN的單泛素化修飾，進(jìn)而改變PTEN蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位，但并不會(huì)對(duì)PTEN蛋白的穩(wěn)定性和蛋白的總量產(chǎn)生影響。因此，能夠特異性去除PTEN蛋白的多聚泛素化

7、修飾、抑制PTEN蛋白降解的DUB就只有USP13被發(fā)現(xiàn)，新的能夠維持PTEN蛋白穩(wěn)定性的DUB分子還有待于進(jìn)一步的發(fā)掘與研究。
　　FoxO（ForkheadboxO）轉(zhuǎn)錄因子是細(xì)胞生命活動(dòng)的重要調(diào)控分子，在細(xì)胞的多項(xiàng)生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。FoxO蛋白與人類多種腫瘤相關(guān)。Akt是FoxO蛋白重要的上游調(diào)控分子之一?；罨腁kt能夠直接使FoxO家族蛋白磷酸化，促進(jìn)其降解，抑制其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。P

8、TEN作為PI3K/Akt信號(hào)通路負(fù)向調(diào)控的核心分子，其蛋白水平對(duì)于FoxO家族分子的功能發(fā)揮具有重要意義。
　　本研究針對(duì)這一問(wèn)題，鑒定了對(duì)PTEN蛋白水平具有正向調(diào)節(jié)作用的DUB，研究其在維持PTEN蛋白穩(wěn)定中所發(fā)揮的作用及產(chǎn)生上述效應(yīng)的分子機(jī)制;明確泛素連接酶CHIP對(duì)PTEN及其下游凋亡通路的影響。
　　研究方法
　　人源DUB家族根據(jù)蛋白的結(jié)構(gòu)和組成特點(diǎn)可分為5個(gè)亞家族，分別是UCH、USP、OTU、Jose

9、phin和JAMM/MPN+家族。我們圍繞PTEN的DUB鑒定這一科學(xué)問(wèn)題，從人源DUB家族全部成員中通過(guò)無(wú)偏性篩選，分別用等量的DUB過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，Westernblot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源PTEN水平，篩選出能夠穩(wěn)定PTEN蛋白水平的去泛素化酶分子OTUD3(OTUdomain-containingprotein3)。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OTUD3與PTEN的相互作用，并確定相互作用區(qū)域。過(guò)表達(dá)OTUD3，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Akt通

10、路的活性。構(gòu)建OTUD3敲低的MCF7細(xì)胞穩(wěn)定株，檢測(cè)OTUD3對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲能力的影響。免疫組化檢測(cè)結(jié)直腸癌組織樣本、Westernblot檢測(cè)乳腺癌組織樣本中OTUD3與PTEN的蛋白水平。通過(guò)DNA測(cè)序篩查乳腺癌組織中OTUD3與PTEN的天然突變體，并構(gòu)建相應(yīng)的過(guò)表達(dá)載體，檢測(cè)這些突變對(duì)PTEN蛋白半衰期的影響。在乳腺癌MCF7細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞MCF10A細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)PTEN特異性泛素連接酶CHIP，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ak

11、t通路的活性、FoxO家族蛋白的活性、Bim的分子水平以及對(duì)凋亡的影響。免疫組化檢測(cè)乳腺癌組織中CHIP與Bim的表達(dá)水平。
　　結(jié)果
　　1.OTU亞家族中的成員OTUD3在過(guò)表達(dá)的情況下可以特異性上調(diào)PTEN蛋白水平，而OTU亞家族的其他成員分子沒(méi)有上調(diào)PTEN蛋白水平的功能，表明OTUD3對(duì)PTEN的調(diào)節(jié)具有特異性。通過(guò)RNAi技術(shù)敲低內(nèi)源OTUD3可引起PTEN蛋白水平的顯著下降，且這一現(xiàn)象在多種細(xì)胞系中可穩(wěn)定重復(fù)。

12、但在細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)OTUD3喪失去泛素化酶活性的突變體OTUD3C76A不但不能使PTEN水平上升，反而使細(xì)胞內(nèi)源PTEN的蛋白水平顯著下降，出現(xiàn)十分明顯的顯性“負(fù)”效應(yīng)。表明細(xì)胞內(nèi)源OTUD3蛋白對(duì)PTEN的調(diào)節(jié)作用在PTEN的穩(wěn)定性維持上具有重要地位，且OTUD3的這一功能依賴于其去泛素化酶活性。
　　2.OTUD3能夠直接與PTEN發(fā)生相互作用，介導(dǎo)二者相互作用的區(qū)域分別為OTUD3的OTU結(jié)構(gòu)域與PTEN的C2結(jié)構(gòu)域，且相互

13、作用不依賴于OTUD3的去泛素化酶活性。本課題匯總了既往文獻(xiàn)中報(bào)道的腫瘤組織中PTENC2結(jié)構(gòu)域的突變，分別為PTEN△M199、PTENP246L、PTEN△T319、PTENF341V、PTENV343E、PTENL345Q、PTENT348I、PTEN1-319和PTEN1-342。在這些PTEN突變蛋白中，PTEN△M199、PTENF341V和PTEN1-319能夠使PTEN喪失與OTUD3的結(jié)合能力，從而使PTEN蛋白穩(wěn)定性

14、降低，半衰期縮短，蛋白水平下降。
　　3.細(xì)胞和分子水平的測(cè)試表明，OTUD3敲低所產(chǎn)生的分子效應(yīng)與細(xì)胞學(xué)效應(yīng)與PTEN敲低所產(chǎn)生的效應(yīng)極為相似，均可導(dǎo)致Akt通路的過(guò)度激活，使細(xì)胞的增殖加快、侵襲能力增強(qiáng)、對(duì)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感性降低。OTUD3敲低對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲能力的影響尤其顯著，在裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中，OTUD3敲低細(xì)胞與PTEN敲低細(xì)胞均可在裸鼠體內(nèi)發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移，且二者嚴(yán)重程度相仿，使得裸鼠在皮下注射細(xì)胞后四周內(nèi)即發(fā)生死亡，裸

15、鼠成瘤實(shí)驗(yàn)無(wú)法完成。這一發(fā)現(xiàn)表明OTUD3在抑制腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色。OTUD3的水平下降或缺失能夠顯著促進(jìn)腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。
　　4.OTUD3與PTEN在人類結(jié)直腸癌組織當(dāng)中亦呈明顯的正相關(guān)，且二者在腫瘤組織中的定位存在一致性。
　　5.我們?cè)谌橄侔┙M織中發(fā)現(xiàn)了OTUD3的兩個(gè)突變蛋白，分別為OTUD3R79T和OTUD3E86K，在乳腺癌細(xì)胞系MCF7中分別梯度過(guò)表達(dá)OTUD3野生型、OTUD3R79T和O

16、TUD3E86K突變蛋白，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)OTUD3R79T能夠使PTEN蛋白水平上調(diào)，與梯度過(guò)表達(dá)野生型OTUD3對(duì)PTEN的調(diào)控效應(yīng)相似;而梯度過(guò)表達(dá)OTUD3E86K卻得到與過(guò)表達(dá)野生型OTUD3相反的效應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)源PTEN水平隨著OTUD3E86K表達(dá)量的增加而顯著下降。這一現(xiàn)象提示OTUD3R79T依然具有維持PTEN蛋白穩(wěn)定性的功能，該突變并沒(méi)有影響OTUD3分子的去泛素化酶活性，而OTUD3E86K則與OTUD3酶活突變體OTU

17、D3C76A類似，過(guò)表達(dá)會(huì)出現(xiàn)“顯性負(fù)”效應(yīng)，成為PTEN水平的負(fù)向調(diào)控分子，提示這一位點(diǎn)氨基酸的突變可能影響到了OTUD3的去泛素化酶活性。過(guò)表達(dá)OTUD3R79T能夠顯著延長(zhǎng)PTEN半衰期，而過(guò)表達(dá)OTUD3E86K使PTEN半衰期顯著縮短。這一結(jié)果再次驗(yàn)證了OTUD3R79T對(duì)PTEN蛋白穩(wěn)定性依然具有維持作用，但OTUD3E86K失去了正常功能，成為了PTEN水平的負(fù)向調(diào)控分子。OTUD3R79T和OTUD3E86K均可與細(xì)胞內(nèi)

18、源PTEN發(fā)生相互作用，且作用強(qiáng)度與野生型OTUD3類似，證明OTUD3R79T和OTUD3E86K之間的功能差異和其與PTEN的相互作用無(wú)關(guān)而可能與其去泛素化酶活性的下降或喪失有關(guān)。
　　6.我們?cè)?0例乳腺癌樣本及相應(yīng)的癌旁組織中篩查PTEN突變，發(fā)現(xiàn)了PTENF341V+I224M、PTENE307K和PTENF341V3個(gè)種PTEN蛋白的突變體。其中PTENF341V失去與OTUD3結(jié)合的能力，其蛋白穩(wěn)定性不能被OTUD3

19、調(diào)控，蛋白半衰期縮短;而PTEN1224M和PTENE307K突變蛋白首次被發(fā)現(xiàn)，二者均能與OTUD3發(fā)生相互作用，且結(jié)合能力與野生型PTEN無(wú)明顯差異。OTUD3能夠維持二者的蛋白穩(wěn)定性，過(guò)表達(dá)OTUD3能夠使二者的半衰期顯著延長(zhǎng)。上述結(jié)果表明PTEN氨基酸序列的I224和E307位點(diǎn)不參與介導(dǎo)PTEN與OTUD3的結(jié)合和OTUD3對(duì)PTEN的穩(wěn)定性維持。
　　7.我們的研究證明了CHIP通過(guò)促進(jìn)PTEN的泛素-蛋白酶體途徑降解

20、使細(xì)胞內(nèi)PTEN蛋白水平下降，PI3K-Akt被過(guò)度激活，高度活化的Akt促進(jìn)了下游FoxO家族分子的磷酸化。被磷酸化修飾的FoxO家族分子活性受到抑制，降解增加。其中的FoxO3分子作為多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要分子，被過(guò)度磷酸化修飾后與bim基因啟動(dòng)子及pten基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合能力均下降，使得bim和pten基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制，從而導(dǎo)致Bim蛋白和PTEN蛋白的合成減少。其中Bim蛋白水平的下降能夠使細(xì)胞凋亡受到抑制，細(xì)胞產(chǎn)生凋亡抑

21、制現(xiàn)象，即細(xì)胞對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感性降低。而PTEN蛋白合成減少會(huì)進(jìn)一步使PTEN蛋白水平下降，從而致使細(xì)胞內(nèi)Akt的磷酸化水平進(jìn)一步升高，F(xiàn)oxO3分子磷酸化比例進(jìn)一步增加，pten基因轉(zhuǎn)錄受到更嚴(yán)重的抑制，從而形成了一個(gè)使PTEN蛋白水平不斷下降的正反饋環(huán)路。即CHIP通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯后修飾水平對(duì)PTEN進(jìn)行雙重機(jī)制的調(diào)節(jié)，這兩種調(diào)節(jié)機(jī)制使得細(xì)胞內(nèi)PTEN水平不斷下降，而這一正反饋的形成最終致使乳腺癌細(xì)胞MCF7和乳腺上

22、皮細(xì)胞MCF10A對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性均顯著下降。對(duì)腫瘤組織的檢測(cè)亦證實(shí)在乳腺癌組織中確實(shí)存在CHIP高表達(dá)的現(xiàn)象，且組織中CHIP的表達(dá)水平與PTEN和Bim的表達(dá)水平成反比。
　　結(jié)論
　　1.OTUD3是PTEN的去泛素化酶，能夠維持PTEN蛋白的穩(wěn)定性。
　　2.OTUD3通過(guò)對(duì)PTEN穩(wěn)定性的調(diào)控發(fā)揮其抑癌功能。
　　3.乳腺癌組織中存在影響OTUD3功能的基因突變。
　　4.泛素連接