去泛素化酶USP10調(diào)控AMPK的功能和作用機(jī)制研究.pdf

1、AMPK（5’AMP-activated protein kinase）即AMP依賴(lài)的蛋白激酶，是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子。AMPK作為細(xì)胞能量感受器，其激活后可通過(guò)開(kāi)啟ATP的補(bǔ)償機(jī)制和關(guān)閉ATP的消耗進(jìn)程，恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)的能量平衡。AMPK參與調(diào)控多種細(xì)胞代謝進(jìn)程，因此，其信號(hào)途徑是研究肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病的核心。
　　AMPK的活性受到嚴(yán)格調(diào)控。當(dāng)外界能量應(yīng)激造成ATP減少，AMP/ATP比值增加，AMP可通過(guò)結(jié)合AM

2、PKγ亞基，促進(jìn)AMPK上游激酶（AMPKK）對(duì)AMPK第172位點(diǎn)的蘇氨酸進(jìn)行磷酸化，進(jìn)而激活A(yù)MPK。當(dāng)前，對(duì)AMPK激活調(diào)控多集中在對(duì)該位點(diǎn)的磷酸化修飾研究上，而其它類(lèi)型的翻譯后修飾是否參與AMPK的激活還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)去泛素化修飾在AMPK激活過(guò)程中發(fā)揮重要作用，且鑒定了首個(gè) AMPK去泛素化酶 USP10，同時(shí)發(fā)現(xiàn)USP10-AMPK通路受到精細(xì)的調(diào)控。因此，對(duì)USP10-AMPK信號(hào)通路的研究將為闡明AMPK

3、信號(hào)通路的作用機(jī)制提供一條新的線索，具有非常重要的意義。
　　本文的研究?jī)?nèi)容及結(jié)論主要包括以下兩個(gè)方面：
　?。ㄒ唬︰SP10調(diào)控AMPKα泛素化及其活性。1）在AMPK激活劑AICAR刺激條件下，我們發(fā)現(xiàn)AMPK的激活伴隨著其自身泛素化修飾水平的下降；2）通過(guò)生物信息學(xué)的方法分析USP10序列，我們鑒定了AMPKα上4個(gè)潛在泛素化位點(diǎn)。點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證實(shí)這些位點(diǎn)的泛素化受到USP10調(diào)控；4）通過(guò)免疫印跡檢測(cè) AMPK下游底物

4、 ACC1，Raptor的磷酸化，我們發(fā)現(xiàn) USP10的敲除抑制了AMPK的激活及其功能；油紅O染色證明，USP10敲除導(dǎo)致脂滴形成顯著提高；5）對(duì)USP10序列分析，我們發(fā)現(xiàn)USP10存在AMPK的潛在磷酸化位點(diǎn)Ser76。利用AMPK磷酸化通用底物抗體檢測(cè)USP10磷酸化，我們發(fā)現(xiàn)能量應(yīng)激上調(diào)胞內(nèi)USP10的磷酸化；體外激酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，AMPK可特異性磷酸化USP10；6）USP10敲除細(xì)胞中回補(bǔ)USP10野生型與S76突變體，

5、實(shí)驗(yàn)證明USP10 S76位點(diǎn)的磷酸化促進(jìn)其激活A(yù)MPK。
　?。ǘ┬∈蟾闻K特異性敲除USP10導(dǎo)致多種代謝損傷。1）我們利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建 USP10肝臟特異性敲除小鼠模型，T7EN1酶切及免疫印跡檢測(cè)USP10肝臟敲除效率；2）對(duì)小鼠表型檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)在肝臟內(nèi)USP10的特異性敲除降低了AMPK的活性及其下游底物磷酸化。3）此外，USP10肝臟敲除小鼠表現(xiàn)出多種代謝缺陷，如甘油三酯、膽固醇及血糖含量明顯升高。

6、高胰島素-正血糖鉗夾實(shí)驗(yàn)證實(shí)，USP10敲除小鼠的葡萄糖灌注速率明顯下調(diào)。
　　綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)了在能量應(yīng)激下，一種放大 AMPK激活信號(hào)的關(guān)鍵分子機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)AMPKα的泛素化會(huì)抑制其激活，而去泛素化酶USP10可以特異性的去泛素化AMPKα激活A(yù)MPK。在能量應(yīng)激下，AMPK反過(guò)來(lái)磷酸化USP10絲氨酸76位點(diǎn)，提高USP10的活性。因此，AMPK與USP10之間形成一種反饋調(diào)控回路，確保能量應(yīng)激下，AMPK激活信號(hào)

7、的放大。小鼠敲除模型證明，對(duì)這種反饋調(diào)控回路的干擾，會(huì)導(dǎo)致 AMPK的激活異常及多種代謝缺陷的發(fā)生。
　　我們的研究揭示了泛素化修飾在 AMPK活性調(diào)控中的新功能，進(jìn)一步加深了我們對(duì)AMPK活性調(diào)控機(jī)制的理解，同時(shí)擴(kuò)展了我們對(duì)于AMPK翻譯后修飾新功能的認(rèn)識(shí)。AMPK由于其重要功能已經(jīng)成為肥胖，胰島素抵抗，2型糖尿病，代謝綜合征，甚至腫瘤等多種疾病的理想治療靶點(diǎn)。AMPK激活劑如二甲雙胍已經(jīng)應(yīng)用于胰島素抵抗，2型糖尿病的臨床治療。

8、鑒于USP10在AMPK激活中的重要作用，其有望為成為上述代謝性疾病的治療靶標(biāo)。
　　第二部分
　　c-ABL（ Abelson tyrosine kinase）是一種非受體酪氨酸激酶，其可與 bcr（breakpoint cluster region）基因發(fā)生融合突變，形成具有高度酪氨酸激酶活性的BCR/ABL融合蛋白。這種突變是造成慢性髓質(zhì)白血?。–ML）的根本原因。
　　BCR/ABL酪氨酸激酶抑制劑（TKI）已

9、經(jīng)作為治療慢性髓質(zhì)白血?。–ML）的一線藥物。然而在臨床治療中，患者對(duì) imatinib及其它 TKI的耐藥性已成為CML治療面臨的新問(wèn)題。當(dāng)前，對(duì) imatinib耐藥性潛在的分子機(jī)制還不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)有絲分裂調(diào)控蛋白 PLK1（Polo-like kinase-1）是 c-ABL的一個(gè)重要的激酶底物。c-ABL可以與PLK1相互作用并磷酸化PLK1，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程及細(xì)胞增殖。同時(shí)，c-ABL介導(dǎo)的PLK1過(guò)表達(dá)與白

10、血病患者的imatinib耐藥性正相關(guān)。因此，對(duì)c-ABL-PLK1信號(hào)通路的研究不但可以進(jìn)一步拓展人們對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)，而且可能為CML及其它腫瘤的治療提供新的組合用藥策略。
　　本文的研究?jī)?nèi)容及結(jié)論主要包括以下四個(gè)方面：
　　（一）c-ABL調(diào)控PLK1蛋白降解及其活性。我們發(fā)現(xiàn)c-ABL磷酸化PLK1，抑制其泛素化降解并提高其活性。1）利用免疫共沉淀與GST-pull down分析，我們證明c-ABL可以與PL

11、K1在體內(nèi)體外發(fā)生直接相互作用；2）通過(guò)找尋二者相互作用區(qū)域，我們發(fā)現(xiàn) PLK1通過(guò) PBD結(jié)構(gòu)域與 c-ABL結(jié)合；c-ABL通過(guò)SH2/SH3，PTKs結(jié)構(gòu)域與PLK1相互作用；3）激酶磷酸化實(shí)驗(yàn)證明，c-ABL可以體內(nèi)體外磷酸化PLK1；通過(guò)質(zhì)譜鑒定，我們發(fā)現(xiàn)c-ABL磷酸化PLK1 Y217， Y425，Y445位點(diǎn)4）過(guò)表達(dá)c-ABL促進(jìn)PLK1蛋白水平表達(dá)；敲除c-ABL抑制PLK1蛋白水平表達(dá)；利用放線菌酮阻抑證明c-AB

12、L抑制PLK1降解；蛋白酶體抑制劑及泛素化實(shí)驗(yàn)證明，c-ABL抑制PLK1通過(guò)泛素化降解；點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證明， c-ABL通過(guò)Y425位點(diǎn)調(diào)控PLK1蛋白穩(wěn)定性；5）同步化細(xì)胞于有絲分裂期，我們證明c-ABL通過(guò)磷酸化PLK1 Y425位點(diǎn)促進(jìn)PLK1的激活。體外磷酸化反應(yīng)證明，PLK1 Y425位點(diǎn)的磷酸化促進(jìn)Aurora A對(duì)其激活。
　?。ǘヽ-ABL磷酸化PLK1調(diào)控有絲分裂進(jìn)程。1）流失細(xì)胞儀檢測(cè)c-ABL敲低HeLa細(xì)胞

13、，我們發(fā)現(xiàn)c-ABL影響細(xì)胞周期進(jìn)程；2）免疫熒光及流式細(xì)胞儀檢測(cè)PLK1野生型與Y425突變株細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)Y425磷酸化影響細(xì)胞G2/M轉(zhuǎn)換；3）激光共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞，進(jìn)一步確定c-ABL介導(dǎo)的PLK1 Y425磷酸化促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂。
　?。ㄈヽ-ABL-PLK1軸影響 CML化療應(yīng)答。1）Real-Time PCR及 Western Blot檢測(cè)臨床CML患者外周血樣本，發(fā)現(xiàn)BCR/ABL與PLK1在CML中

14、高表達(dá)；與 imatinib敏感患者相比，PLK1在 imatinib抗性患者體內(nèi)表達(dá)更高；2） imatinib有效降低臨床患者CML中PLK1蛋白表達(dá)水平；3）K562細(xì)胞過(guò)表達(dá)PLK1抑制其對(duì)imatinib的化療應(yīng)答；4）c-ABL與PLK1抑制劑聯(lián)合用藥顯著提高CML細(xì)胞的化療應(yīng)答；5）構(gòu)建imatinib抗性CML小鼠模型，證實(shí)聯(lián)合用藥延長(zhǎng)CML腫瘤模型小鼠存活時(shí)間。
　?。ㄋ模ヽ-ABL-PLK1軸影響宮頸癌腫瘤增殖

15、及病人存活率。1）通過(guò)收集臨床宮頸癌組織樣本，發(fā)現(xiàn) c-ABL與 PLK1在宮頸癌中高表達(dá)，同時(shí)在腫瘤組織中PLK1具有高度酪氨酸磷酸化修飾；2）裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)證明，PLK1 Y425位點(diǎn)突變抑制腫瘤增殖；3）臨床隨訪數(shù)據(jù)證明，PLK1酪氨酸磷酸化與不良預(yù)后正相關(guān)；4）聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)證明，c-ABL，PLK1抑制劑促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的化療應(yīng)答。
　　綜上所述，我們的研究揭示了c-ABL-PLK1軸在有絲分裂進(jìn)程及CML化療應(yīng)答中的重要功能