VRK1及BANF1在食管癌發(fā)病和增殖過程中表達及其相關分子機制的初步研究.pdf

1、目的:
　　研究VRK1及其下游基因BANF1對鱗狀食管癌細胞的細胞周期及侵襲的影響，初步探討發(fā)病過程中可能存在的分子機制。
　　方法:
　　1.VRK1和BANF1在組織中的表達定位檢測
　　采用免疫組化方法檢測食管癌不同病理組織部位的VRK1和BANF1表達及其定位，初步分析其與食管癌的進展是否相關。
　　2.不同食管癌分級的細胞中BANF1和VRK1表達的定量檢測
　　1)對不同食管癌分級的細胞

2、內(nèi)VRK1和BANF1進行RNA提取，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后采用實時熒光定量PCR技術(rt-PCR)，比較二者擴增曲線和溶解曲線，確定二者在不同分級的食管癌細胞中的表達量高低。
　　3.初步研究VRK1和BANF1在食管癌細胞增殖過程的分子機制
　　1)干擾VRK1(siVRK1)最佳序列的確定以vrk-homo-176、vrk-homo-571，vrk-homo-862為試驗靶基因合成干擾序列，以Western blot結果為依據(jù)篩

3、選最佳干擾序列(siRNA)。
　　2)Western blot檢測siVRK1后食管癌細胞系中VRK1的表達敲低效果以及BAF蛋白的表達水平，以驗證BANF1作為VRK1的下游基因這一理論。
　　3)CCK-8及流式細胞術轉(zhuǎn)染、孵育后的細胞于OD450處檢測吸光度，其具體數(shù)值可反映細胞增殖能力及細胞周期的改變。采用流式細胞術檢測轉(zhuǎn)染成功后的食管癌細胞，可明確細胞周期受到影響的具體時期。
　　4.統(tǒng)計學分析
　　

4、統(tǒng)計分析采用SPSS21.0軟件，實驗數(shù)據(jù)分析方法包括:兩組獨立樣本之間采用t檢驗進行組間差異分析，多組計量資料之間采用單因素方差分析進行比較，兩組資料之間采用LSD-t檢驗進行比較，檢驗水準為α=0.05。
　　結果:
　　1.VRK1和BANF1的表達與腫瘤分級之間的代表性免疫組織化學結果顯示，120例正常食管組織中VRK1和BANF1的陽性率的分別為15.8％和13.3％。85例高分化的食管癌組織中陽性率為75.3％和

5、71.8％。在35例低分化食管癌組織中，陽性率為94.3％和91.4％。二者在在腫瘤分級上的差異均具有統(tǒng)計學意義(NVRK1=120,P=0.02;N BANF1=120,p=0.002)
　　2.腫瘤組織中VRK1和BANF1mRNA表達水平均高于鄰近正常組織，兩組間配對t檢驗結果顯示差異均具有統(tǒng)計學意義(N VRK1=120，P=0.044;N BANF1=120，p=0.040)。
　　3.Western blot試驗

6、結果證明，siVRK571序列最有效，在兩株細胞中均有良好敲低效果，干擾VRK1后BANF1的表達明顯降低。CCK-8檢測結果顯示siVRK后，細胞增殖能力減弱。流式檢測結果顯示，細胞轉(zhuǎn)染siRNA后，細胞周期較多的阻滯在S期后，S期上升，M分裂期下降，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　　1.VRK1及BANF1在食管癌細胞中表達升高，其高表達在食管鱗狀細胞癌的病程進展中可能發(fā)揮重要作用，并且與不良預后相關。
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