葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)的泛素化調控介導糖尿病腎病足細胞的損傷.pdf

1、第一部分高糖通過増加G6PD的泛素化降解降低足細胞內G6PD的表達
　　目的：觀察高糖高脂對足細胞增殖、凋亡、細胞骨架以及氧化還原的影響，過表達G6PD能否改善，以及研宄G6PD泛素化修飾的情況。
　　方法：檢測高糖高脂培養(yǎng)下足細胞體內cleaved caspase-3的表達；檢測高糖培養(yǎng)下足細胞體內NADPH、GSH/GSSG、細胞內R O S聚集情況；利用MTT方法檢測高糖培養(yǎng)對足細胞的增殖的影響；利用鬼筆環(huán)肽熒光染色的

2、方法檢測高脂培養(yǎng)下足細胞F-actin排列的情況；利用質粒構建技術構建pCDNA3.0-Flag-G6PD質粒。足細胞按照實驗目的分組，正常葡萄糖（N G，5.6mmol/L)、高濃度葡萄糖（H G，25mmol/L)、高濃度葡萄糖同時加過表達G6 P D腺病毒（HG/Ad2)及高濃度葡萄糖同時加空載腺病毒（HG/Laz); BSA對照、500pmol/L棕櫚酸、500pmol/L棕櫚酸加G6PD腺病毒、500^mol/L棕櫚酸加空載腺

3、病毒。HEK293T細胞按照實驗目的分組：His-Ub質粒轉染組;His-Ub和Flag-G6PD質粒共轉染組;His-Ub質粒轉染+MG132(20uM)組;His-Ub和Flag-G6PD質粒共轉染+MG132(20uM)組。質粒轉染48小時之后，R IP A裂解液裂解細胞，用Anti-Flag beads富集細胞裂解液中Flag-G6PD的蛋白，用H is的抗體進行G6PD泛素化的檢測。Input樣品利用Westernblot方法

4、及抗體檢測相應的蛋白。
　　結果：1、下糖下脂引起的足細胞的調亡，能夠被過表達的G6PD所改善。
　　2、高脂培養(yǎng)能夠使足細胞的F-actin骨架紊亂和氧化還原的失衡，G6 P D過表達則能夠逆轉這一現(xiàn)象。
　　3、通過質粒構建技術，成功構建pCDNA3.0-Flag-G6PD質粒。
　　4、與其他組相比，His-Ub和 Flag-G6PD質粒共轉染+MG132組能夠顯著增加G6PD的泛素化修飾。
　　結論

5、：過表達G6PD可以部分逆轉高糖高脂對足細胞增殖、凋亡、形態(tài)和氧化還原的影響以及高糖通過泛素蛋白酶體途徑降低足細胞內G6PD的表達。
　　第二部分V H L參與G6PD泛素蛋白酶體途徑的降解
　　目的：查找并驗證介導G6PD泛素化降解的E3酶。
　　方法：利用質粒構建技術，構建質粒pCDNA3.0-HA-VHL。利用酵母雙雜交技術成功的篩選參與G6 P D的泛素化的E3酶。免疫共沉淀實驗,HEK293T細胞按照實驗目的

6、分為2個組：H A-V H L質粒轉染組、：Flag-G6PD和 H A-V H L質粒共轉染組。兩組在轉染的最后6小時均加入MG132(20uM)，Co-IP裂解液裂解細胞，用Anti-Flag beads富集細胞裂解液中：Flag-G6PD的蛋白，用 H A的抗體檢測H A-V H L蛋白。體內泛素化實驗，HEK293T細胞按照實驗目的分為3組：His-Ub質粒轉染組；Flag-G6PD和His-Ub質粒共轉染組；Flag-G6PD

7、、His-Ub和 HA-VHL質粒共轉染組。在轉染的最后6小時均加入MG132(20uM)，R IP A裂解液裂解細胞，用 Anti-Flag beads富集細胞裂解液中Flag-G6PD的蛋白，用 H is的抗體進行G6PD泛素化的檢測。Input樣品利用Westernblot方法及抗體檢測相應的蛋白。
　　結果：1、利用質粒構建技術，成功構建質粒pCDNA3.0-HA-VHL。
　　2、利用酵母雙雜交實驗篩選出與G6 P